尚 磊，王周利，高振鵬

（1.寶雞市特種設(shè)備檢驗(yàn)所，陜西寶雞 721000；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌 712100）

釀酒酵母廣泛應(yīng)用于生活中，在食品生產(chǎn)中也得到了廣泛的利用，如饅頭的發(fā)酵、面包的生產(chǎn)、醬油的生產(chǎn)等，不僅在食品生產(chǎn)中得到了應(yīng)用，在工業(yè)生產(chǎn)中也得到了廣泛應(yīng)用，包括工業(yè)生產(chǎn)乙醇、生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白等方面[1-5]。對(duì)釀酒酵母胞內(nèi)物質(zhì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，利用有機(jī)試劑提取，對(duì)胞內(nèi)物質(zhì)淬滅、提取條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在為提高釀酒酵母胞內(nèi)物質(zhì)提取的利用率提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株、試驗(yàn)試劑

釀酒酵母，由實(shí)驗(yàn)室提供。

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉，以上均為分析純，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供；甲醇，色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心提供；高氯酸、乙醇，分析純，天津市化學(xué)試劑一廠提供。

1.2 主要儀器與設(shè)備

滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；離心機(jī)，美國(guó)Labconco公司產(chǎn)品；水浴鍋，上海司樂儀器廠產(chǎn)品；分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司產(chǎn)品。

1.3 培養(yǎng)基及試劑的配制

（1） 培養(yǎng)基的配制。菌株的培養(yǎng)采用YPD培養(yǎng)基；將配制好后于120℃條件下滅菌20 min，待用。

（2）試劑的配制。40%，60%，80%甲醇淬滅試劑；高氯酸提取試劑、沸乙醇提取試劑、純甲醇提取試劑。

2 試驗(yàn)方法

2.1 菌株的活化

將凍存的甘油管的釀酒酵母用YPD培養(yǎng)基活化，完成第2次活化后待用[6-8]。

2.2 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將活化好的菌種以2%的比例用移液槍接種到已滅菌的培養(yǎng)基中，于28℃條件下發(fā)酵培養(yǎng)，分別培養(yǎng)至 0，2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，24 h后取樣，利用分光光度計(jì)測(cè)定OD值。每次調(diào)零時(shí)均用未接種的培養(yǎng)基調(diào)零，以減小誤差，并記錄數(shù)據(jù)。

2.3 樣品的淬滅

采用3種淬滅試劑淬滅，即40%，60%，80%甲醇淬滅試劑。取對(duì)數(shù)期的菌液5 mL加入預(yù)冷的淬滅試劑中，于-20℃條件下淬滅30 min，然后以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心5 min，然后用相同的淬滅試劑清洗2次，離心得到的沉淀用提取試劑提取[9-13]。

2.4 樣品提取

樣品經(jīng)過淬滅后，采用高氯酸提取法、冷甲醇反復(fù)凍融、沸乙醇提取3種方法提取。

（1） 用5 mL 10%（V/V） 高氯酸重懸酵母菌體，放入液氮中，然后在冰浴上解凍，反復(fù)3次。離心、吸取上清液，用10 mol/L的KOH溶液中和至pH值為7；離心、去沉淀，吸取上清液冷凍干燥。

（2） 2 mL的純甲醇懸浮淬滅的酵母泥，在液氮中反復(fù)凍融3次，離心吸取上清液，再次用純甲醇清洗，渦旋振蕩30 s，合并2次上清液，冷凍干燥。

（3）5 mL沸乙醇溶液重懸淬滅后的酵母菌體。于90℃水浴中保溫3 min，隨后立即放入冰浴冷卻3 min；離心后吸取上清液，冷凍干燥。

2.5 硅烷化衍生

酵母細(xì)胞經(jīng)過淬滅提取、冷凍干燥得到的粉末，由于較多的代謝物含有極性官能團(tuán)，并且其具有不穩(wěn)定性和不揮發(fā)性，在上機(jī)測(cè)定前需要硅烷化衍生，從而有利于代謝物分子結(jié)構(gòu)的確定。根據(jù)需要，以吡啶作為溶劑，乙氧基胺作為污化試劑，MSTFA作為硅烷化試劑，進(jìn)行衍生反應(yīng)，污化衍生90 min，硅烷化衍生30 min，衍生溫度40℃。

2.6 氣相色譜-質(zhì)譜條件

（1）色譜柱。DB-17MS毛細(xì)管色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；采用自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度300℃，載氣為He（純度99.99%），不分流進(jìn)樣，流量1 mL/min，進(jìn)樣體積1 μL。

（2） 程序升溫。起始溫度為100℃，保持2 min，以5℃/min的速度升溫至200℃，再以10℃/min的速度升溫至300℃，保持3 min。

（3）質(zhì)譜條件。電子轟擊電離（EI），電子能量70 eV，離子源溫度250℃，接口溫度280℃，質(zhì)量掃描范圍 50～500 m/z。

3 結(jié)果與分析

3.1 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

對(duì)酵母細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)提取檢測(cè)，各個(gè)時(shí)期不一樣，一般選取微生物生長(zhǎng)相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，選取對(duì)數(shù)后期或者穩(wěn)定期可以可靠反應(yīng)微生物的代謝情況。

釀酒酵母生長(zhǎng)曲線見圖1。

圖1 釀酒酵母生長(zhǎng)曲線

由圖1可以看出，釀酒酵母生長(zhǎng)速度較快，從適應(yīng)期開始進(jìn)入穩(wěn)定期僅僅用了將近10 h的時(shí)間，在2～8 h，釀酒酵母處于對(duì)數(shù)期，此時(shí)期酵母快速生長(zhǎng)，在10 h之后趨于穩(wěn)定，為了提取釀酒酵母的胞內(nèi)物質(zhì)，根據(jù)圖1選擇12 h取樣，12 h后基本趨于穩(wěn)定，方便下一步研究。

3.2 代謝組淬滅的優(yōu)化

對(duì)不同的方法淬滅，文獻(xiàn)已有報(bào)道，根據(jù)試驗(yàn)需要，采用不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇水溶液進(jìn)行淬滅，經(jīng)過40%，60%，80%的甲醇水溶液淬滅后，采用冷甲醇-反復(fù)凍融提取的方法，采用GC-MS進(jìn)行評(píng)價(jià)。

40%的甲醇水溶液淬滅的GC-MS離子流色譜見圖2，60%的甲醇水溶液淬滅的GC-MS離子流色譜見圖3，80%的甲醇水溶液淬滅的GC-MS離子流色譜見圖4。

圖2 40%的甲醇水溶液淬滅的GC-MS離子流色譜

圖3 60%的甲醇水溶液淬滅的GC-MS離子流色譜

選用不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇水溶液（40%，60%，80%）對(duì)穩(wěn)定期的釀酒酵母淬滅，在硅烷化衍生后采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)其效果評(píng)估，從提取的數(shù)量上來看，60%的甲醇水溶液淬滅效果最好，提取物質(zhì)最多，達(dá)到82種，分別由40%，60%，80%的甲醇水溶液作淬滅試劑，純冷甲醇為提取試劑，采用GC-MS評(píng)價(jià)其效果，3種得到的代謝物數(shù)量分別為61，78，51 種。

圖4 80%的甲醇水溶液淬滅的GC-MS離子流色譜

不同體積分?jǐn)?shù)淬滅試劑提取的物質(zhì)種類見表1。

表1 不同體積分?jǐn)?shù)淬滅試劑提取的物質(zhì)種類/個(gè)

由表1可以看出，不同的物質(zhì)種類數(shù)量組成，60%的甲醇水溶液淬滅效果最好，所以選擇此試劑作為最優(yōu)淬滅試劑。

3.3 不同提取試劑的優(yōu)化

上述試驗(yàn)確定了60%的甲醇水溶液作為最優(yōu)淬滅試劑，此試驗(yàn)采用高氯酸、純甲醇、沸乙醇作為提取試劑，以此來提取釀酒酵母胞內(nèi)物質(zhì)，并采用GC-MS對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)，并對(duì)檢測(cè)到的物質(zhì)進(jìn)行歸類匯總。

不同提取方法代謝物見表2。

表2 不同提取方法代謝物/個(gè)

由表2可以看出，3種提取試劑中高氯酸提取效果最差，純甲醇和沸乙醇效果較好，純甲醇的提取物質(zhì)達(dá)到83種，效果最好，甲醇具有一定的極性，沸乙醇提取的效果僅次于純甲醇的效果，由于實(shí)際操作中，沸乙醇具有揮發(fā)性，對(duì)于提取的物質(zhì)的定量計(jì)算有一定的影響，因此選擇純甲醇作為提取試劑。

4 結(jié)論

通過比較酵母胞內(nèi)物質(zhì)淬滅與提取的方法，不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇水溶液作為淬滅試劑，然而在60%體積分?jǐn)?shù)下，淬滅效果最佳。在3種提取試劑中，沸乙醇和冷甲醇效果較好，但根據(jù)實(shí)際需要，選用效果最好的冷甲醇作為提取試劑，以利下一步的研究。

[1] 陳洪奇，于欣水，張明明，等.硫酸鋅添加對(duì)釀酒酵母乙酸脅迫條件下全局基因轉(zhuǎn)錄的影響 [J].微生物學(xué)通報(bào)，2017，44（6）：1 312-1 321.

[2] 程書梅，李慧穎，顧金蘭，等.釀酒酵母的乳酸抗性機(jī)制 [J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，51（2）：367-368.

[3] 杜昭勵(lì).釀酒酵母脅迫耐受性改造及精氨酸在乙醇脅迫耐受性中的作用研究 [D].北京：中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，2014.

[4] 杜君，李海蘭，李慧，等.銅離子脅迫對(duì)葡萄汁中釀酒酵母的影響 [J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43（15）：3 259-3 265.

[5] 方華，李灝.海藻糖與熱激蛋白在釀酒酵母耐受乙醇脅迫中的作用 [J].中國(guó)生物工程雜志，2014，34（6）：84-89.

[6] 李春生.庫德畢赤酵母重金屬積累特性及高鹽/低pH值下鎘抗性提高機(jī)理研究 [D].青島：中國(guó)海洋大學(xué)，2015.

[7] 李倩倩，王燕.產(chǎn)甘油假絲酵母抗逆轉(zhuǎn)錄因子的過表達(dá)對(duì)釀酒酵母耐酸脅迫性的影響 [J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2017（6）：1-7.

[8] 李陽陽，徐懷德.蕎麥保健酒生產(chǎn)釀制菌株篩選 [J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2015（6）：25-28，32.

[9] 路曉偉.醬香型白酒釀造中釀酒酵母生理代謝及基因組學(xué)特征 [D].無錫：江南大學(xué)，2015.

[10] Larsen M R，Larsen P M，F(xiàn)ey S J，et al.Characterization of differently processed forms of enolase 2 from Saccharomyces cerevisiae by two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry[J].Electrophoresis， 2015， 22（3）：566-575.

[11] Dombek K M，Ingram L O.Ethanol production during batch fermentation with Saccharomyces cerevisiae：changes in glycolytic enzymes and internal pH[J].Appl Environ Microbiol，1987，53 （6）：1 286-1 291.

[12] Coote P J，Cole M B，Jones M V.Induction of increased thermotolerance in Saccharomyces cerevisiae may be triggered by a mechanism involving intracellular pH[J].Journal of General Microbiology，1991（7）：1 701-1 705.

[13] Graves T，Narendranath N V，Dawson K，et al.Effect of pH and lactic or acetic acid on ethanol productivity by Saccharomyces cerevisiae，in corn mash[J].Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology，2006，33 （6）：469-474.◇