張慧珍，黃世平，楊瑞瑞，曾幼玲

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830046)

0 引 言

【研究意義】鹽脅迫影響植物生長和作物的產(chǎn)量。在應(yīng)對(duì)鹽脅迫過程中，植物通常會(huì)采用不同的機(jī)制來避免鹽離子過度累積造成的損傷[1]。在這錯(cuò)綜復(fù)雜的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，miRNA對(duì)靶基因的調(diào)控就是其中的一種?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】miRNA是一類長度約為21 nt的非編碼小RNA。它們能夠直接對(duì)mRNA進(jìn)行切割或者阻止其翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控編碼基因的表達(dá)[2, 3]。鑒定miRNA與靶基因間的靶向關(guān)系，一方面，通過生物信息學(xué)獲得miRNA預(yù)測(cè)的靶基因，另一方面設(shè)計(jì)試驗(yàn)進(jìn)一步鑒定miRNA與這些潛在靶基因的關(guān)系。研究方法主要包括：(1) 利用qRT-PCR驗(yàn)證miRNA與靶基因的負(fù)相關(guān)性，即在靶基因與miRNA的轉(zhuǎn)錄水平看兩者的表達(dá)是否存在調(diào)控關(guān)系[4]；(2) 5′ RLM-RACE分析miRNA與靶基因的靶向切割位點(diǎn)，能直接證明miRNA對(duì)靶基因的靶向切割關(guān)系[5, 6]；(3) 將靶基因與GFP或GUS等報(bào)告基因融合，通過煙草瞬時(shí)表達(dá)體系，直觀地驗(yàn)證miRNA與靶基因的互作關(guān)系[7, 8]。miRNA在植物中具有高度保守性、時(shí)序性和組織特異性，在各種生物學(xué)進(jìn)程中都扮演著重要角色，miR167是作用于生長素信號(hào)通路上的一類miRNA，它通過靶向ARFs來調(diào)控下游生長素響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。有文獻(xiàn)報(bào)道，miR167主要靶向的是ARF6和ARF8兩個(gè)成員[9, 10]。最近的研究表明，在植物的生長發(fā)育中，ARF6和ARF8參與雌蕊群和雄蕊群的發(fā)育，其過表達(dá)會(huì)促進(jìn)雌、雄蕊的發(fā)育或?qū)е轮参镌缡靃9-12]。牽牛(Ipomoea.nil)開花時(shí)期miR167表達(dá)量最低，ARF8的表達(dá)量卻是最高的，二者的表達(dá)模式呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性。大豆miR167c在根部表達(dá)上調(diào)，通過靶向GmARF8a和GmARF8b直接調(diào)控根瘤的數(shù)目[13]。Jodder等[14]探究不同脅迫條件下番茄miR167a的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，發(fā)現(xiàn)真菌或病毒感染及冷脅迫提高了miR167a的表達(dá)水平，而鹽、旱和熱處理導(dǎo)致其下調(diào)表達(dá)，表明不同的脅迫可能激活了番茄miR167a不同的調(diào)控途徑。鹽脅迫下，miR167在擬南芥[15]和中間錦雞兒(Caraganaintermedia)[16]中都呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，這可能是通過調(diào)節(jié)ARF的表達(dá)，影響植物生長素響應(yīng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，減緩了植物的生長和發(fā)育，并且通過這種方式提高植物的脅迫耐受性[17]。【本研究切入點(diǎn)】鹽穗木(Halostachyscaspica)隸屬藜科(Chenopodiaceae)鹽穗木屬(Halostachys)，對(duì)鹽分適應(yīng)性極強(qiáng)，能夠高度富集Na+和Cl-[18-21]。研究是基于課題組前期構(gòu)建的高鹽脅迫下鹽穗木根的小RNA文庫數(shù)據(jù)[22]，依據(jù)測(cè)序拷貝數(shù)篩選受鹽誘導(dǎo)表達(dá)顯著下調(diào)的miR167d及利用鹽穗木轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)到的靶基因ARF8為研究對(duì)象。【擬解決的關(guān)鍵問題】探討鹽脅迫下鹽穗木miR167d及預(yù)測(cè)靶基因ARF8在高鹽(600 mmol/L NaCl)脅迫下的表達(dá)模式和相關(guān)性；同源克隆方法結(jié)合RACE技術(shù)，克隆獲得鹽穗木ARF8全長序列并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。該文為進(jìn)一步研究鹽穗木miR167d和預(yù)測(cè)靶基因ARF8的耐鹽生物學(xué)功能和調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

鹽穗木種子采自新疆古爾班通古特沙漠邊緣，培養(yǎng)基質(zhì)按1∶1∶1 (花土∶珍珠巖∶蛭石)的比例配置。置于溫室中生長(25℃，光照時(shí)間16 h/d，相對(duì)濕度40%)，植株生長大約90 d實(shí)施鹽脅迫處理。600 mmol/L NaCl處理鹽穗木0、3、12、24、48、72 h (自來水澆灌的鹽穗木作為對(duì)照)，取其同化枝為試驗(yàn)材料，液氮速凍并保存于-80℃冰箱用于后續(xù)的基因表達(dá)熒光定量試驗(yàn)。

煙草種子播種于花盆中，培養(yǎng)基質(zhì)按2∶1∶1(花土∶珍珠巖∶蛭石)配制，置于溫室中生長(25℃，光照時(shí)間16 h/d，相對(duì)濕度40%)，每周澆一次自來水。

1.2 方 法

1.2.1 RNA提取

RNA的提取步驟參照北京天根Plant Total RNA提取試劑盒的操作說明。

1.2.2 鹽穗木miR167d與ARF8的反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR

利用polyA加尾法對(duì)total RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照TaKaRa公司SYBR?PrimeScriptTMmiRNA RT-PCR Kit進(jìn)行miRNA的熒光定量實(shí)驗(yàn)。

按照M-MLV Reverse Transcriptase試劑盒(TaKaRa)和Oligo(dT)18 primer等反轉(zhuǎn)錄試劑合成cDNA用于定量分析。按照SYBR?Select Master Mix(Applied Biosystems)操作說明進(jìn)行靶基因的熒光定量試驗(yàn)。ABI 7500熒光定量PCR儀進(jìn)行熒光定量實(shí)驗(yàn)，用2-△△Ct方法計(jì)算miRNA和靶基因的相對(duì)表達(dá)量，Prism5.0分析并作圖。

按照SMARTerTM RACE cDNA (Clontech)擴(kuò)增試劑盒，以RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成5'-RACE-Ready-cDNA和3'-RACE-Ready-cDNA，用于靶基因RACE實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 鹽穗木預(yù)測(cè)靶基因ARF8的克隆、理化性質(zhì)及同源分析

分別以5'-RACE-Ready-cDNA和3'-RACE-Ready-cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物回收后，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化，測(cè)序鑒定正確后，通過拼接，獲得全長序列，進(jìn)而設(shè)計(jì)引物(HcARF8-P1；HcARF8-P2 )，擴(kuò)增HcARF8的全長序列(引物序列信息見表1)。NCBI Conserved Domain Search(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)在線預(yù)測(cè)其保守性，分析鹽穗木ARF8蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域。表1

1.2.4 農(nóng)桿菌注射法轉(zhuǎn)化煙草葉片

利用鹽穗木轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)未找到其miR167d前體。通過鹽穗木和擬南芥的miR167d成熟體比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)僅存一個(gè)堿基的差異，推測(cè)擬南芥miR167d的成熟體可能對(duì)鹽穗木miR167d預(yù)測(cè)的靶基因同樣存在靶向切割，故分別構(gòu)建可能包含有擬南芥miR167d剪切位點(diǎn)的pCAMBIA1301-HcARF8-GFP和pCAMBIA2300-AtmiR167d相關(guān)的植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，鑒定正確后，擬通過煙草瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)鑒定擬南芥miR167d對(duì)鹽穗木ARF8是否具有靶向作用。

將鑒定正確的農(nóng)桿菌EHA105單菌液培養(yǎng)至OD600為0.8～1.0，12 000 r/min離心1 min，收集菌細(xì)胞，用重懸液[10 mmol/L MES-KOH，10 mmol/L MgCl2，0.1 mmol/L乙酰丁香酮(acetosyringone )]重懸，單菌液OD600調(diào)為0.5，混合菌液OD600調(diào)為1.0，室溫靜置4 h；用去掉針頭的1 mL注射器吸取菌液，用注射器針頭在葉片上輕輕劃出小孔，用裝有菌液的注射器壓住小孔，慢慢用力，將菌液分別或共轉(zhuǎn)入生長狀態(tài)良好、健壯的煙草葉片(避開葉脈)中；3～5 d后撕取葉片下表皮，于Nikon ECLIPSE Ti熒光顯微鏡下觀察。

表1 試驗(yàn)所用引物序列
Table 1 Primer sequences used in the experiments

名稱Name引物Primer 引物序列 (5’-3’)Primer sequences (5’-3’)qRT-PCRRmiR167dTGAAGCTGCCAGCATGATCTGRHcARF8-P1/P2TGGTCCTTGGGAGGCATTCTTG/CTTGAAGAGGGTATGCGGGGATHc5S rRNA-P1/P2ACCCGATCCCATTCCGAC/TGTCTCCCGAACAATCTCAGTACHcβ-actin-P1/P2AAGATCTGGCACCACACCTTC/CACACCATCACCAGAATCGAHcARF8HcARF8-P1/P2ATGAAGCTTTCAACATCAGGATTG/GTACGTCTCAGTCCCTTGCTTCCHcARF8 5'RACE-OuterGACCATCTCCAAGGAGAAGTACATCATTCHcARF8 5'RACE-InnerCTCCCTGTCGACAAATACAAGCTGCCAGHcARF8 3'RACE-OuterGTTGGGGAAGCAAGGGACTGAGACGTACHcARF8 3'RACE-InnerAGACCATATCCCCGCATACCCTCTTCUPM (Long)CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTUPM (Short)CTAATACGACTCACTATAGGGCNUPAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT煙草瞬時(shí)實(shí)驗(yàn)pCAMBIA2300-AtmiR167d-P1 (SacI)GAGCTCTGTTGGTTTTTAGAAGCTGAAGCpCAMBIA2300-AtmiR167d-P2 (BamHI)CTGCAGTGTTGGTGATTTAGTGACTGAAGpCAMBIA1301-HcARF8-GFP-P1 (SacI)GAGCTCATGTCCCGGTTCAGCAGCTATCATGpCAMBIA1301-HcARF8-GFP-P2 (PstI)GGATCCGTACGTCTCAGTCCCTTGCTTCC

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽穗木miR167d與靶基因的靶向預(yù)測(cè)

根據(jù)靶向關(guān)系的基本原則[23, 24]，利用高鹽脅迫下鹽穗木根的小RNA文庫和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)信息分析，鹽穗木miR167d預(yù)測(cè)的靶基因?yàn)辂}穗木ARF8，其作用的靶位點(diǎn)靠近編碼區(qū)3'端位置。鹽穗木miR167d成熟體與擬南芥miR167各成員的成熟體比對(duì)有1～4個(gè)堿基的差異。圖1

圖1 鹽穗木miR167d的靶基因預(yù)測(cè)(A)以及與擬南芥miR167各成員成熟體的比對(duì)(B)
Fig.1 Predicting target gene ofHalostachyscaspicamiR167d (A) and alignmenting with AtmiR167 family members (B)

2.2 鹽脅迫下鹽穗木miR167d與其預(yù)測(cè)靶基因HcARF8的表達(dá)模式

qRT-PCR檢測(cè)到鹽穗木miR167d和ARF8都受到600 mmol/L NaCl高鹽脅迫的誘導(dǎo)。高鹽脅迫處理48 h，鹽穗木同化枝miR167d顯著上調(diào)表達(dá)并與HcARF8呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)性。HcARF8的表達(dá)隨著鹽脅迫時(shí)間的延長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。同時(shí)，結(jié)合生物統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件(IBM SPSS Statistics V19)對(duì)鹽穗木miR167d及其靶基因ARF8進(jìn)行了相關(guān)系數(shù)分析。圖2，表2

注：差異極顯著***/**(P<0.01)；差異顯著*(P<0.05)

Note:P<0.01 was extremely significant (***/**) andP<0.05 was significant (*)

圖2 600 mmol/L NaCl處理鹽穗木同化枝miR167d (A)及其預(yù)測(cè)靶基因HcARF8 (B)的相對(duì)表達(dá)模式 (C)
Fig.2 The relative expression of miR167d (A) and its predictive target geneARF8 (B) at the treatment of 600 mmol/L NaCl in theHalostachyscaspicabranches (C)
表2 高鹽脅迫處理鹽穗木同化枝miR167d與預(yù)測(cè)靶基因ARF8的相關(guān)性分析
Table 2 Correlation analysis on miR167d and its target geneARF8 at the treatment of 600 mmol/L NaCl in theHalostachyscaspicabranches

處理TreatmentR2P值P value 顯著水平Significant3 h (600 mmol/L NaCl )0.7230.1045ns48 h (600 mmol/L NaCl)-0.94570.0043**600 mmol/L NaCl-0.80440.0292*

注：差異極顯著**(P<0.01)；差異顯著*(P<0.05)

Note:P<0.01 was extremely significant (**) andP<0.05 was significant (*)

2.3 煙草瞬時(shí)表達(dá)體系鑒定擬南芥miR167d對(duì)鹽穗木ARF8的靶向作用

選取包含miR167d靶位點(diǎn)的鹽穗木ARF8片段(252 bp)和AtmiR167d(377 bp)分別構(gòu)建到植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-GFP和pCAMBIA2300上，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，單獨(dú)及同時(shí)注射煙草葉片，用熒光顯微鏡觀察瞬時(shí)轉(zhuǎn)化后煙草表皮中GFP融合蛋白的表達(dá)情況。轉(zhuǎn)化了pCAMBIA1301-HcARF8-GFP后，在激發(fā)光的作用下，煙草細(xì)胞中有綠色熒光，位于保衛(wèi)細(xì)胞氣孔周圍(圖3A, B)；而將pCAMBIA1301-HcARF8-GFP與pCAMBIA2300-AtmiR167d同時(shí)轉(zhuǎn)入煙草葉片后，表皮細(xì)胞中無綠色熒光(圖3C, D)，這些都以野生型為對(duì)照(在明場(chǎng)、熒光場(chǎng)中均無熒光)(圖3E, F)。圖3

注：A, B分別為轉(zhuǎn)化pCAMBIA1301-HcARF8-GFP的明場(chǎng)及熒光場(chǎng)下的煙草表皮細(xì)胞；C, D分別為轉(zhuǎn)化pCAMBIA1301-HcARF8-GFP與pCAMBIA2300-AtmiR167d的明場(chǎng)及熒光場(chǎng)下煙草表皮細(xì)胞；E, F分別為野生型煙草明場(chǎng)及熒光場(chǎng)下的表皮細(xì)胞

Note: The tobacco epidermal cells were detected under the bright field and the fluorescent field by the observation of fluorescence microscope, which were transformedHcARF8-GFP fused gene with the plant expression vector pCAMBIA1301byagrobacteriummediated method (A, B),HcARF8-GFP andAtmiR167d with the vector pCAMBIA1301and pCAMBIA2300 by the same method (C, D) and those of wild type ( E, F), respectively

圖3 煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系鑒定擬南芥miR167d與鹽穗木生長素響應(yīng)因子ARF8的靶向作用
Fig.3 Targeting verification ofArabidopsismiR167d andHalostachyscaspicaauxin response factorARF8 using tobacco transient expression system

2.4 鹽穗木生長素信號(hào)通路中靶基因ARF8的克隆

利用RACE方法克隆獲得了鹽穗木miR167d預(yù)測(cè)的靶基因ARF8序列，全長為2 861 bp，ORF 2 442 bp，編碼813個(gè)氨基酸。鹽穗木ARF8推測(cè)的氨基酸序列與同科植物甜菜(Betavulgaris)ARF8的同源性最高，達(dá)到87%。

NCBI Conserved Domain Search (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)對(duì)其保守性進(jìn)行預(yù)測(cè)，含有能與B3 DNA綁定元件、生長素響應(yīng)元件，生長素誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄IAA超家族的元件結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，表明該蛋白是生長素響應(yīng)因子。圖4

圖4 鹽穗木ARF8全長基因的克隆(A)及編碼蛋白結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)(B)
Fig.4 Cloning ofHalostachyscaspicaARF8 full length gene (A) and predictive structure domain of this speciesARF8 (B)

3 討論

鹽穗木是一種荒漠極端耐鹽植物，其莖葉已高度肉質(zhì)化[25]。很多研究報(bào)道m(xù)iR167調(diào)控生長素信號(hào)通路中的ARF基因，它作為一個(gè)調(diào)節(jié)子參與信號(hào)通路的調(diào)控，不僅調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育，還調(diào)控植物應(yīng)對(duì)各種環(huán)境脅迫[9, 10, 13, 17]。實(shí)驗(yàn)主要開展了高鹽脅迫下鹽穗木同化枝miR167d及其靶基因ARF8的表達(dá)模式以及相關(guān)性研究。

該文從前期獲得的高鹽脅迫下鹽穗木根的小RNA文庫和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中生物信息學(xué)分析miR167d與預(yù)測(cè)的靶基因具有一定的靶向性。NaCl高鹽脅迫real-time PCR的檢測(cè)結(jié)果顯示了鹽穗木同化枝miR167d表達(dá)顯著上調(diào)，Liu等[15]和Zhu等[16]在擬南芥和中間錦雞兒中也發(fā)現(xiàn)類似的miR167上調(diào)表達(dá)的情況。對(duì)高鹽濃度不同時(shí)間點(diǎn)脅迫處理的鹽穗木，其同化枝中miR167d與其靶基因的表達(dá)呈現(xiàn)極顯著的負(fù)相關(guān)性 (表2和圖2)[4]。擬南芥miR167d與鹽穗木miR167d成熟體僅存在一個(gè)堿基的差異，煙草瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示擬南芥miR167d對(duì)鹽穗木ARF8起到了剪切作用，這個(gè)結(jié)果間接地能推斷鹽穗木miR167d對(duì)其預(yù)測(cè)的靶基因HcARF8存在靶向切割，這與之前相關(guān)文獻(xiàn)中的報(bào)道[7, 8, 26]相一致。

根據(jù)前期課題組獲得的miR167d的靶基因ARF8轉(zhuǎn)錄組的序列信息，通過RACE的方法，獲得了HcARF8基因的全長序列(2 861 bp)，NCBI在線BLAST發(fā)現(xiàn)HcARF8編碼的氨基酸序列與同科植物甜菜的同源性達(dá)到87%，鹽穗木ARF8存在能與生長素相關(guān)的元件(B3 DNA綁定元件、生長素響應(yīng)元件，生長素誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄IAA超家族的元件)結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，這也進(jìn)一步證實(shí)了該序列就是HcARF8。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究鹽穗木miR167d和靶基因HcARF8之間的調(diào)控和生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

以高鹽(600 mmol/L NaCl)處理48 h鹽穗木根的小RNA文庫中篩選到差異表達(dá)的miR167d和從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中預(yù)測(cè)到其靶基因HcARF8作為研究對(duì)象。熒光定量PCR試驗(yàn)證明高鹽脅迫下鹽穗木同化枝中miR167d和預(yù)測(cè)靶基因均響應(yīng)高鹽脅迫，且脅迫48 h時(shí)，二者的表達(dá)量呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)性，結(jié)合煙草瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)的結(jié)果可以推斷鹽穗木miR167d與鹽穗木ARF8存在靶向關(guān)系；進(jìn)而利用同源克隆方法結(jié)合RACE技術(shù)獲得了鹽穗木miR167d的靶基因HcARF8的全長序列(2 861 bp)，生物信息學(xué)分析與同科植物種甜菜ARF8同源性達(dá)到87%，都具有與生長素相關(guān)元件結(jié)合的功能域。

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