陶睿 張一凡 高育哲 劉綺夢(mèng) 杜明珠 趙迪

摘要：采用乙醇浸提法對(duì)小米麩皮中黃酮類化合物進(jìn)行提取，并通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳工藝參數(shù)為：乙醇濃度56%，料液比1∶9（g/mL），提取溫度77 ℃，提取時(shí)間146 min。

關(guān)鍵詞：小米麩皮;乙醇浸提法;優(yōu)化;響應(yīng)面法

中圖分類號(hào)：TS210.9? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? 文章編號(hào)：1674-1161（2018）05-0039-06

小米麩皮即小米殼，其中含大量營(yíng)養(yǎng)成分和活性因子，可以預(yù)防心血管疾病、癌癥、糖尿病等疾病。黃酮類化合物常見(jiàn)于自然界中，本課題擬采用乙醇浸提法從小米麩皮中提取總黃酮，并通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為小米麩皮的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品小米：市售，產(chǎn)地為遼寧省北票市。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）：上海金穗生物科技有限公司;乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AXTD5A型轉(zhuǎn)子離心機(jī)：美國(guó)科峻儀器公司;UV-1200S型紫外分光光度計(jì)：上海翱藝儀器有限公司;HH-6型數(shù)顯電子恒溫水浴鍋：常州國(guó)華電器有限公司;JLGJ-45型礱谷機(jī)：杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品預(yù)處理 將帶殼小米經(jīng)礱谷機(jī)進(jìn)行脫粒處理，得到小米麩皮。然后將小米麩皮用多功能粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎研磨，過(guò)80目篩，分裝，備用。

1.3.2 提取工藝流程 粉碎過(guò)篩后的小米麩皮粉末加乙醇溶解→水浴提取→離心后取上清液→過(guò)濾→利用比色法測(cè)定溶液吸光度，計(jì)算總黃酮含量

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精確稱取干燥且質(zhì)量恒定的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，用無(wú)水乙醇將其溶解并定容于25 mL容量瓶中。分別吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.8 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL比色管中，依次加入5.0 mL無(wú)水乙醇和0.3 mL 5% NaNO2溶液，搖勻后放置6 min，再加入0.3 mL Al（NO3）3溶液，搖勻后放置6 min，再加入4.0 mL NaOH溶液，用無(wú)水乙醇補(bǔ)齊刻度，搖勻后放置10 min。以無(wú)水乙醇作空白對(duì)比，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，建立蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 單因素試驗(yàn) 1） 乙醇濃度對(duì)提取率的影響。稱量1 g小米麩皮粉末，在料液比1∶8（g/mL），提取時(shí)間2 h，提取溫度50 ℃，乙醇濃度分別為40%，50%，60%，70%，80%，90%的條件下進(jìn)行提取，浸提液離心后取上清液，測(cè)定吸光度。2） 料液比對(duì)提取率的影響。稱量1 g小米麩皮粉末，在乙醇濃度60%，提取時(shí)間2 h，提取溫度50 ℃，料液比分別為1∶4，1∶6，1∶8，

1∶10，1∶12（g/mL）的條件下進(jìn)行提取，浸提液離心后取上清液，測(cè)定吸光度。3） 提取溫度對(duì)提取率的影響。稱量1 g小米麩皮粉末，在料液比1∶8（g/mL），乙醇濃度60%，提取時(shí)間2 h，提取溫度分別為40，50，60，70，80，90 ℃的條件下進(jìn)行提取，浸提液離心后取上清液，測(cè)定吸光度。4） 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響。稱量1 g小米麩皮粉末，在料液比1∶8（g/mL），乙醇濃度60%，提取溫度50 ℃，提取時(shí)間分別為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h的條件下進(jìn)行提取，浸提液離心后取上清液，測(cè)定吸光度。

1.3.5 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn) 根據(jù)乙醇提取小米麩皮中總黃酮單因素試驗(yàn)結(jié)果，將吸光度值作為響應(yīng)值，采用中心組合設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面分析。試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=12.736 0 X+0.005 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 5，說(shuō)明在0.005～0.036 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，可用于定量分析。

2.2 提取工藝單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇濃度的影響 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響如圖2所示。

由圖2可以看出：提取液的吸光度值隨著乙醇濃度增加呈先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)乙醇濃度達(dá)到50%時(shí)，吸光度值最大;之后吸光度值緩慢減小;當(dāng)乙醇濃度為80%～90%時(shí)，吸光度值基本平穩(wěn)。確定最佳乙醇濃度為50%。

2.2.2 料液比的影響 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響如圖3所示。

由圖3可以看出：提取液的吸光度值隨著料液比增大呈先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)料液比達(dá)到1∶8

（g/mL）時(shí)，吸光度值最大;當(dāng)料液比再增大時(shí)，吸光度值開(kāi)始減小。確定最佳料液比為1∶8（g/mL）。

2.2.3 提取溫度的影響 提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響如圖4所示。

由圖4可以看出：提取液的吸光度值隨著提取溫度升高呈逐漸增大的趨勢(shì)。當(dāng)提取溫度達(dá)到80 ℃時(shí)，吸光度值最大;當(dāng)提取溫度為90 ℃時(shí)，吸光度值急劇減小，這可能是因?yàn)楦邷貙?dǎo)致乙醇揮發(fā)，且破壞了黃酮結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)變成水溶性的黃酮。確定最佳提取溫度為80 ℃。

2.2.4 提取時(shí)間的影響 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響如圖5所示。

由圖5可以看出：提取液的吸光度值隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)而增大。當(dāng)提取時(shí)間為2.5 h時(shí)，吸光度值最大;但提取時(shí)間為2.0 h的吸光度值與2.5 h的吸光度值相差無(wú)幾，說(shuō)明提取2.0 h已將黃酮基本都提出，提取2.5 h反而浪費(fèi)時(shí)間。確定最佳提取時(shí)間為2.0 h。

2.3 提取工藝響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)乙醇提取小米麩皮中總黃酮的單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理優(yōu)化工藝參數(shù)，進(jìn)行響應(yīng)面分析。分別選取4個(gè)變量的低中高3個(gè)水平：乙醇濃度40%，50%，60%;料液比1∶6，1∶8，1∶10（g/mL）;提取溫度70，80，90 ℃;提取時(shí)間1.5，2.0，2.5 h。共設(shè)計(jì)29組試驗(yàn)，其中24組為分析試驗(yàn)，5組為中心試驗(yàn)，以估計(jì)誤差。具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3.2 回歸模型方差分析 利用Box-Behnken進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到提取液吸光度值（Y）與各單因素A（乙醇濃度）、B（料液比）、C（提取溫度）、D（提取時(shí)間）之間的二次多項(xiàng)式模型式：Y=0.720+0.018 A-0.012 B-0.016 C+0.056 D+0.011 AB-0.013 AC+0.005 AD-0.004 BC-0.004 BD+0.011 CD-0.074 A2-0.025 B2-0.025 C2-0.033 D2?；貧w模型方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知：回歸模型具有高度的顯著性（P<0.000 1），決定系數(shù)R2=0.985 6，校正決定系數(shù)RAdj2=0.971 1，失擬項(xiàng)P=0.055 6>0.050 0（不顯著），說(shuō)明該回歸模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合程度較高，可以用該模型分析和預(yù)測(cè)乙醇提取小米麩皮中總黃酮的工藝結(jié)果。由F值可知，4個(gè)因素對(duì)提取液吸光度值的影響大小依次為提取時(shí)間（D）>乙醇濃度（A）>提取溫度（C）>料液比（B）。由P值可知，回歸模型中的一次項(xiàng)均極顯著，其中乙醇濃度（A）、提取溫度（C）、提取時(shí)間（D）均為極顯著，料液比（B）顯著;二次項(xiàng)均為極顯著;交互項(xiàng)AB，AC和CD顯著。

2.3.3 響應(yīng)面交互作用分析 預(yù)測(cè)值與真實(shí)值對(duì)比如圖6所示，各點(diǎn)的分布幾乎在一條直線上，表示模型擬合效果較好。

響應(yīng)面圖及等高線圖如圖7—圖12所示。

由圖7—圖12可以看出：4個(gè)因素之間的交互作用對(duì)提取液的吸光度值影響顯著。圖7、圖8、圖9和圖10中等高線近似橢圓形，說(shuō)明它們之間的交互作用對(duì)提取液吸光度值影響較大。

利用Design-Expert 8.0.6.1軟件分析得到的回歸方程求解，得出最佳提取工藝條件為：乙醇濃度56%，料液比1∶9 （g/mL），提取溫度77 ℃，提取時(shí)間146 min;此時(shí)提取液的吸光度值最高。

3 結(jié)論

經(jīng)單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面法優(yōu)化分析，得出乙醇浸提小米麩皮中總黃酮的最佳工藝為：乙醇濃度56%，料液比1∶9 g/mL，提取溫度77 ℃，提取時(shí)間146 min。

參考文獻(xiàn)

[1] 薛月圓，李鵬，林勤保.小米的化學(xué)成分及物理性質(zhì)的研究進(jìn)展[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2008，23（3）：199-203.

[2] 史宏，史關(guān)燕，楊成元，等.小米的營(yíng)養(yǎng)保健及食療價(jià)值的探討[J].雜糧作物，2007，27（5）：376-378.

[3] 田志琴.小米多酚類活性物質(zhì)的提取及抗氧化性研究[D].鄭州：河南工業(yè)大學(xué)，2011.

[4] 付麗紅，任文靜，李玉娥.“沁州黃”小米總黃酮提取工藝的研究[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，36（3）：220-223.

Reaction Surface Method Used to Determine the Extraction Conditions

of Flavonoids from Millet Bran

TAO Rui， ZHANG Yifan*， GAO Yuzhe， LIU Qimeng， DU Mingzhu， ZHAO Di

（College of Grain Science and Technology， Shenyang Normal University， Shenyang 110034， China）

Abstract： Using ethanol extraction to extract flavonoids of millet bran by the response surface method of total flavonoids of millet bran ethanol concentration， solid-liquid ratio， extraction temperature and extraction time were optimized， the optimum extraction conditions for： ethanol concentration was 56%， and solid-liquid ratio of 1∶9 （g/mL）， extraction temperature is 77 ℃， the extraction time was 146 min.

Key words： millet bran; ethanol extraction; optimize; The Response Surface Method