周生研，張博文，魏元鋒，錢 帥，張建軍，高 緣*

(中國(guó)藥科大學(xué) 1中藥學(xué)院；2藥學(xué)院，南京211198)

藥物共晶是指將一種藥物與另一種非活性或活性藥物通過(guò)非價(jià)鍵以固定化學(xué)計(jì)量比結(jié)合在同一晶格中形成的晶體[1]。近幾年來(lái)已成為改善藥物的理化性質(zhì)[2]、提高穩(wěn)定性[3]和生物利用度[4]，改善藥效，獲得新的適應(yīng)癥或降低不良反應(yīng)的創(chuàng)新性技術(shù)[5]，同時(shí)還有可能獲得知識(shí)產(chǎn)權(quán)的保護(hù)[6-7]。例如，諾華公司研發(fā)經(jīng)FDA和EMA批準(zhǔn)上市的治療心力衰竭的共晶制劑沙庫(kù)比曲纈沙坦片(商品名EntrestoTM)就是一個(gè)典型范例[5]，該產(chǎn)品成功運(yùn)用共晶技術(shù)同時(shí)提高了兩種生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)(BCS)Ⅱ類難溶性藥物的溶解溶出度，使其易于吸收，更好地發(fā)揮臨床療效。

黃芩素(baicalein，BE，圖1-A)是天然植物黃芩的主要成分，現(xiàn)代研究表明，BE具有抗腫瘤、抗艾滋病毒、抗菌、抗肥胖、抗氧化、抗病毒等多種藥理作用[8-14]，目前在臨床上主要用于抗菌消炎和抗感染，加之其對(duì)血液細(xì)胞及肝細(xì)胞等正常細(xì)胞無(wú)毒性，BE具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值及前景。然而，BE屬于BCS Ⅱ類藥物[4]，親水性差、溶解度低、口服生物利用度差，大大限制了其臨床應(yīng)用。目前，已有利用共晶技術(shù)來(lái)改善其溶解度和口服生物利用度的研究，例如黃芩素-煙酰胺共晶[4，15]?？Х纫?caffeine，CA，圖1-B)是中樞系統(tǒng)興奮藥物，常用于減少疲勞和治療困倦，屬于GRAS(Generally Recognized As Safe)的小分子配體[16]，具有多個(gè)吸電子基團(tuán)，在共晶制備上具有優(yōu)勢(shì)，有研究表明咖啡因與楊梅素制備成共晶，可以顯著地提高楊梅素的特性溶出速率[17]。因此，本研究選擇咖啡因作為共晶形成物，與BE制備成共晶，旨在通過(guò)共晶技術(shù)提高BE溶出度和生物利用度。

Figure1 Chemical structures of baicalein (BA,A) and caffeine (CA,B)

1 材 料

1.1 藥品與試劑

黃芩素(BE，純度98.58%)、黃芩苷(純度98.97%)(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司)；咖啡因(純度≥99.5%，康豐生物科技)；木犀草素(純度99.3%，上海標(biāo)準(zhǔn)生物技術(shù)有限公司)；羧甲基纖維素鈉(上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；抗壞血酸鈉、肝素鈉(185 IU/mg)(上海阿拉丁化學(xué)試劑有限公司)；試驗(yàn)用水為采用Milli-Q水純化系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)制得；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

BS 110 S電子天平(德國(guó)Sartorius公司)；Leica DM LM/P偏光顯微鏡(德國(guó)萊卡公司)；差示掃描熱分析儀(德國(guó)Netzsch公司)；紅外光譜儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；D8 Advance X射線衍射儀(德國(guó)Burker AXS公司)；高效液相色譜儀(SPD-10A檢測(cè)器，LC-10AD泵，LC-Solution色譜工作站，日本島津公司)。

1.3 動(dòng) 物

實(shí)驗(yàn)用健康SD大鼠SPF級(jí)，均為雄性，體重230～270 g，南京青龍山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)為SCXK(浙)2008-0033。

2 方 法

2.1 BE-CA共晶的制備

采用混懸液結(jié)晶法，將BE與CA按1∶1的物質(zhì)的量比投料。稱取黃芩素405.4 mg與咖啡因291.3 mg，置于一個(gè)合適大小的干凈玻璃容器中。量取甲醇30 mL至容器內(nèi)，用可透氣的薄膜覆蓋，于25 ℃條件下攪拌約5 h。將所得混懸液抽濾，所得產(chǎn)物于25 ℃條件下減壓干燥12 h，即得。

2.2 BE-CA共晶的表征

2.2.1 熱重分析(TGA) 采用熱重分析法可以測(cè)定制備得到的共晶的晶體結(jié)構(gòu)中是否含有溶劑分子。升溫速率為20 ℃/min，范圍為30～350 ℃。數(shù)據(jù)用熱分析軟件處理。

2.2.2 差示掃描量熱法(DSC) 分別將BE、CA、二者的物理混合物(物質(zhì)的量比1∶1)(PM)以及制備所得的共晶(BE-CA)樣品過(guò)100目篩(約150 μm)，備用。將這些樣品分別置于鋁坩堝中，升溫速率為10 ℃/min，測(cè)定范圍為25～300 ℃。數(shù)據(jù)用Netzsch-Proteus熱分析軟件(Version 4.2)處理。

2.2.3 傅里葉紅外光譜法(FTIR) 分別將BE、CA、PM及BE-CA共晶與KBr壓成薄片，在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。數(shù)據(jù)用 Nicolet Omnic 紅外光譜處理軟件 (Version 8.0)處理。

2.2.4 X射線粉末衍射法(PXRD) 采用Cu-Kα靶，波長(zhǎng)為1.540 562 ?，管壓40 kV，管流40 mA，步長(zhǎng)0.02°，掃描速度2°/min，掃描范圍5～45°。

2.2.5 掃描電鏡(SEM) 取BE-CA共晶樣品適量，均勻散落于粘有黑色雙面膠的載玻片上(厚度15～20 nm)，激發(fā)電壓控制20 kV，在真空條件下將試樣表面噴金處理后，置于掃描電鏡下觀察，拍照，考察樣品的外觀和形態(tài)。

2.3 化學(xué)計(jì)量比的測(cè)定

稱取BE-CA共晶10 mg于25 mL量瓶中，精密稱定，加入甲醇溶解并定容至刻度，搖勻。精密移取上述溶液1 mL于10 mL量瓶中，加入流動(dòng)相溶解并定容至刻度。采用HPLC法測(cè)定，以外標(biāo)法測(cè)定并計(jì)算共晶中黃芩素與咖啡因的物質(zhì)的量比。

HPLC系統(tǒng)采用Kromasil ODS C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，柱溫為30 ℃；以甲醇-0.05%磷酸(70∶30)為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為275 nm，靈敏度0.05 aufs；進(jìn)樣體積 20 μL。黃芩素的線性范圍是0.102～28.56 μg/mL，咖啡的線性范圍是1.40～19.6 μg/mL。該方法分離度良好，重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高。

2.4 平衡溶解度的測(cè)定

分別測(cè)定BE和BE-CA共晶在水及各種pH緩沖液中的溶解度。分別量取水、0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 2.5、5.0、6.8、7.4)及醋酸鹽緩沖液(pH 3.6、4.5)各5 mL置于西林瓶中，加入過(guò)量的藥物后將西林瓶密封置于25 ℃恒溫振蕩器。振搖達(dá)到平衡后，取瓶中混懸液過(guò)0.22 μm水膜，濾液經(jīng)適當(dāng)稀釋后進(jìn)樣進(jìn)行HPLC分析，計(jì)算溶解度。

2.5 表觀溶出速率

分別將BE、CA、PM和BE-CA共晶過(guò)100目篩，使樣品粉末粒徑范圍均一。按照溶出度與釋放度測(cè)定法《中華人民共和國(guó)藥典》(2015年版)第二法(槳法)裝置，轉(zhuǎn)速50 r/min，在溶出杯中加入介質(zhì)900 mL，于37 ℃平衡保溫。溶出介質(zhì)為0.01 mol/L HCl、水和磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)。精密稱定相當(dāng)于5 mg黃芩素的樣品加入溶出介質(zhì)中，于5、10、15、30、45和60 min取樣，并及時(shí)補(bǔ)加等量的恒溫介質(zhì)，0.22 μm水膜過(guò)濾，采用HPLC測(cè)定溶出度。

2.6 特性溶出速率(IDR)

特性溶出速率的研究采用改良的Wood法進(jìn)行[18]，稱取BE及BE-CA共晶約200 mg，用壓片機(jī)壓制成直徑為8 mm致密規(guī)整的藥片，其兩個(gè)圓形表面的表面積為0.502 4 cm2。將藥片的底面和側(cè)面用蜂蠟?zāi)Ｐ桶?，使其只有一個(gè)圓形表面外露，可以與溶出介質(zhì)接觸。

溶出試驗(yàn)方法依照《中華人民共和國(guó)藥典》關(guān)于溶出度測(cè)定的要求，在37 ℃條件下，將制備的用蜂蠟包裹的藥片分別置于裝有水、0.01 mol/L HCl和pH 6.8的磷酸鹽緩沖液900 mL的溶出杯中，攪拌槳的轉(zhuǎn)速為50 r/min。于5、10、15、30、45、60和120 min取樣，并及時(shí)補(bǔ)加等量的恒溫介質(zhì)，0.22 μm水膜過(guò)濾，HPLC測(cè)定溶出度。用累積的單位表面積溶出量與時(shí)間繪制回歸曲線，其斜率作為特性溶出速率，計(jì)算公式為：

IDR=(dW/dt)(1/S)=DCS/h

其中：IDR為特性溶出速率(mg·min-1·cm-2)；dW為藥物溶解的變化量(mg)；dt為時(shí)間的變化量(min)；S為藥片的表面積(cm2)；D為擴(kuò)散系數(shù)(cm2·s-1)；Cs為物質(zhì)的飽和溶解度(mg·cm-3)；h為擴(kuò)散層的厚度(cm)。

2.7 BE-CA共晶的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究

2.7.1 給藥方案及樣品采集 將SD大鼠隨機(jī)分成3組，每組6只，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，可自由飲水，按劑量為每kg體重120 mg BE分別灌胃給予0.5% CMC-Na配制的黃芩素混懸液、物理混合物混懸液及黃芩素-咖啡因共晶混懸液，給藥后分別于0，0.083，0.167，0.5，1，1.5，2，4，6，8，10，12，24 h從大鼠眼眶后靜脈叢取血約200 μL，置肝素化離心管中，以10 000 r/min 離心5 min，取上層血漿，于-20 ℃冰箱保存。

2.7.2 血漿樣品處理 取血漿100 μL，加入木犀草素內(nèi)標(biāo)溶液(152 μg/mL)5 μL和0.5 mol/L KH2PO4溶液50 μL(內(nèi)含1%抗壞血酸鈉)，振蕩混勻；加入乙腈150 μL，渦旋10 min，10 000 r/min 離心10 min，取上清液即得處理后的血漿樣品。

2.7.3 HPLC色譜條件 采用Kromasil ODS C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，柱溫為30 ℃；以甲醇-0.2%磷酸(57∶43)為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為276 nm，靈敏度0.05 AuFs；進(jìn)樣體積20 μL。色譜圖中黃芩苷、木犀草素和黃芩素的保留時(shí)間分別為4.7、6.1和11.8 min，分離度良好且不被血漿內(nèi)雜峰所干擾。黃芩苷及黃芩素分別在0.050 2～25.11 μg/mL(r2=0.998 6，n=6)及0.142 5～22.80 μg/mL(r2=0.996 4，n=6)范圍內(nèi)有良好的線性。BE的檢測(cè)限及定量限分別為9.41和25.11 ng/mL，而B(niǎo)E的檢測(cè)限及定量限分別為12.45和36.12 ng/mL。該方法回收率、精密度良好，樣品穩(wěn)定性高，可以滿足測(cè)定需求。

2.7.4 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用DAS2.0軟件分析處理，采用統(tǒng)計(jì)矩法對(duì)灌胃給予BE，BE與咖啡因物理混合物(物質(zhì)的量比1∶1)和BE-CA共晶的血藥濃度-時(shí)間曲線進(jìn)行分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 共晶的表征

3.1.1 熱重分析法(TGA) HPLC測(cè)定結(jié)果表明，BE-CA共晶中的BE和CA百分含量分別為(58.36±0.80)%和(42.11±0.48)%，可推斷在共晶中BE和CA的化學(xué)計(jì)量比為1∶1。

由于制備BE-CA共晶的溶劑為甲醇，屬于無(wú)基因毒性的第二類溶劑。由TGA圖2可知，共晶在200 ℃以上才開(kāi)始失重，遠(yuǎn)高于甲醇的沸點(diǎn)(65 ℃)，說(shuō)明BE-CA共晶中不含甲醇溶劑分子，不是甲醇溶劑化物。

Figure2 Thermogravimetric thermogram of BE (a),CA (b) and BE-CA cocrystal (c)

3.1.2 差示掃描量熱法(DSC)分析 由DSC圖3可知，BE和CA分別在267.34 ℃和236.29 ℃處分別存在一個(gè)非常尖銳的吸熱熔融峰，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[4,19]。物理混合物PM在180.03 ℃處有較寬的吸熱熔融峰，可能是由于兩者形成了低共熔物。而B(niǎo)E-CA共晶在199.27 ℃附近有單一且尖銳的吸熱熔融峰，說(shuō)明它是不同于兩種單純藥物及其物理混合物的一種晶體新物質(zhì)。

3.1.3 紅外光譜(FT-IR)分析 由紅外光譜圖(圖4)可知，BE的羰基峰υC=O位于1 656.9 cm-1，且酚羥基υO(shè)H在3 412.2 cm-1處峰形較寬，說(shuō)明了BE本身的5-OH和4C=O 形成了分子內(nèi)氫鍵[20]；CA中羰基υC=O峰位于1 699.3 cm-1，υC=N峰位于1 657.8 cm-1，均與文獻(xiàn)報(bào)道一致[21]。物理混合物PM的IR圖為兩種單組分譜圖的簡(jiǎn)單疊加。

Figure3 Differential scanning calorimetry thermograms of BE,CA,physical mixture (PM) and BE-CA cocrystal

Figure4 FTIR spectra for BE,CA,PM and BE-CA cocrystal

由BE-CA共晶的紅外光譜圖可知，在形成共晶后，BE的酚羥基υO(shè)H峰由3 412.2 cm-1移至3 316.9 cm-1，且峰形變寬。同時(shí)，υC=O峰由1 656.9 cm-1紅移至1 645.0 cm-1。說(shuō)明BE中的酚羥基-OH、C=O的氧原子均可能參加了共晶中氫鍵的形成。CA中的υC=O峰一直保持在1 699.3 cm-1，未發(fā)生變化。但υC=N由1 657.8 cm-1移動(dòng)到1 666.3 cm-1，8號(hào)位的γC-H由972.0 cm-1、861.2 cm-1移動(dòng)至978.1 cm-1、857.0 cm-1，表明CA分子中C=N的N原子和=C-H的H原子都可能參與了氫鍵的形成，這與報(bào)道的CA-丙酸共晶形成相似[19]。

3.1.4 X射線粉末衍射法分析 由圖5可知，BE的特征衍射峰在10.20°、11.32°、13.20°、15.32°、23.81°、26.18° 和 28.67° 2θ，CA的特征衍射峰在11.97°、23.99°、26.37°、26.98°和28.36° 2θ，均與文獻(xiàn)報(bào)道一致[22-23]。物理混合物PM譜圖為兩種單組分譜圖的疊加。而B(niǎo)E-CA共晶的粉末X射線衍射峰與物理混合物明顯不同，出現(xiàn)了新的特征衍射峰(3.49°、6.15°、7.02°、9.44°、12.25°、14.25°、23.87°、24.69°、26.93°和28.99° 2θ)，表明其為不同于BE及CA的新晶體。

Figure5 X-ray powder diffraction patterns of BE,CA,PM and BE-CA cocrystal

3.1.5 掃描電子顯微鏡(SEM) 由掃描電子顯微鏡圖中可以看出，與本課題組之前研究報(bào)道的呈短棒狀BE晶體[22](圖6-A)不同，所制備的BE-CA共晶(圖6-B)呈現(xiàn)長(zhǎng)針狀。

Figure6 Scanning electron microscope diagram for BE (A) and BE-CA cocrystal (B)

3.2 共晶的體外溶出行為研究

3.2.1 平衡溶解度的測(cè)定 由圖7可知，由于黃芩素上的酚羥基呈酸性，所以黃芩素和共晶的溶解度均隨pH的增加而增加；但在不同pH環(huán)境下，共晶的溶解度均顯著高于黃芩素。BE及BE-CA共晶在水中的溶解度分別為(16.82±0.52)μg/mL 及(38.11±1.05)μg/mL，共晶在水中的溶解度較黃芩素顯著增加。

3.2.2 表觀溶出度 BE、PM和BE-CA共晶在不同介質(zhì)中溶出度的考察見(jiàn)圖8，采用溶出效率(Dissolution efficiency，DE)[25-26]對(duì)樣品在0.01 mol/L鹽酸溶液、水和pH 6.8的磷酸鹽緩沖液中的溶出進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表1。

Table1 Dissolution efficiency of different samples

MaterialDissolution mediaDistilled water0.01 mol/L HClPBS(pH 6.8) BE2.86±0.422.62±0.6516.45±1.46PM3.41±0.223.12±0.2726.45±0.92BE-CA4.92±0.154.27±0.2041.59±0.74

DE按如下公式(1)計(jì)算：

(1)

其中，y為藥物在t時(shí)刻的溶出度。

結(jié)果可知，PM和BE-CA共晶與BE的溶出均具有pH依賴性，pH越高，溶出度越大，且在3種溶出介質(zhì)中，BE-CA共晶的溶出程度均顯著高于BE晶體及PM。在pH 6.8的磷酸鹽緩沖液中，BE-CA共晶60 min時(shí)的溶出度分別是BE及PM的2.53和1.57倍。

3.2.3 特性溶出速率 BE、PM和BE-CA共晶在不同介質(zhì)中BE的特性溶出見(jiàn)圖9，結(jié)果可知在3種不同溶出介質(zhì)中，共晶中BE的溶出速率均高于BE及物理混合物；經(jīng)擬合計(jì)算特性溶出速率，與單純BE相比，形成BE-CA共晶后，溶出速率提高了2.5～5倍。

Figure9 Intrinsic dissolution profiles of BE from crystalline BE,PM and BE-CA cocrystal in (A) 0.01 mol/L HCl,(B) water,and (C) pH 6.8 phosphate buffer (n=6)

Solid formsBEtmax /hcmax /(g/mL)AUC0-24 h/(μg·h/mL)BItmax /hcmax /(g/mL)AUC0-24 h/(μg·h/mL)BE0.167±01.67±0.853.05±0.561.50±08.83±1.4274.96±7.92PM0.167±01.85±0.263.12±0.121.50±011.39±0.6380.51±3.77BE-CA0.167±05.85±1.03*7.62±1.35*1.00±0*24.92±2.42*231.44±4.79*

*P<0.05vsBE group

3.3 共晶的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究

灌胃給予BE、PM及BE-CA共晶后，大鼠體內(nèi)原性藥物BE及活性代謝物黃芩苷(BI)的血藥濃度經(jīng)時(shí)曲線如圖10所示。給藥后大鼠體內(nèi)活性代謝物BI的血藥濃度經(jīng)時(shí)曲線均呈現(xiàn)了雙峰現(xiàn)象。該現(xiàn)象的原因是由于胃腸道直接吸收的BE在腸上皮細(xì)胞和肝臟中酶的作用下被代謝為BI，形成了BI的第1個(gè)血藥濃度高峰；之后血液中的BI經(jīng)肝腸循環(huán)，在腸內(nèi)被酶解生成BE，吸收后的BE在腸上皮細(xì)胞及肝臟中酶的作用下又被代謝為BI，即形成BI的第2個(gè)血藥濃度高峰[27-28]。

體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究表明，單劑量給藥24 h后，與BE晶體組相比，物理混合物PM組的BE及代謝物BI的血藥峰濃度(cmax)、達(dá)峰時(shí)間(tmax)和AUC等藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)均沒(méi)有明顯變化(表2)，說(shuō)明CA對(duì)BE的吸收及代謝影響較小。然而，在給予BE-CA共晶后不僅縮短了BE及BI的達(dá)峰時(shí)間(tmax)，血藥峰濃度(cmax)提高了2.8～3.5倍，藥時(shí)曲線下面積(AUC)提高2.5～3倍，顯著提高了黃芩素的吸收。這主要是由于共晶改變了黃芩素原有的結(jié)構(gòu)，提高其溶解度和溶出度，從而提高了其生物利用度。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用混懸液結(jié)晶法制備出長(zhǎng)針狀BE-CA共晶，根據(jù)紅外圖譜推測(cè)，共晶中BE分子4位C=O和5位-OH分別與CA中8位=C-H和9位C=N可能形成了氫鍵。體外溶出實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究表明，BE-CA共晶不僅有效地改善了BE的溶解度和溶出速率，同時(shí)顯著提高了BE的體內(nèi)吸收及其與活性代謝物BI的生物利用度，為BE的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)及臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。