陳 葉, 閆 芳, 馬銀山, 羅光宏

(1.河西學院 農(nóng)業(yè)與生物技術學院, 甘肅 張掖 734000； 2.甘肅省河西走廊特色資源利用省級重點實驗室, 甘肅 張掖 734000； 3.甘肅省微藻開發(fā)中心, 甘肅 張掖 734000)

植物從種子萌發(fā)到幼苗生長是其生活史中最敏感的時期，極易受到外界環(huán)境各種因子的影響[1]。干旱脅迫會推遲種子的萌發(fā)或降低發(fā)芽力，因此，它是種子種子發(fā)芽過程中的一個主要的限制性因素[2]。種子萌發(fā)對干旱脅迫的響應反映了其適應局部環(huán)境的生態(tài)機制[3]。窄葉鮮卑花(Sibiraeaangustata)為薔薇科灌木，生于山坡灌木叢、山谷、砂石灘上，分布于甘肅，青海，四川，西藏藏族自治區(qū)等地，是青藏高原的特有種，尤以北緯31°以北和34°以南區(qū)域最為集中[4]。其樹形美觀，葉色翠綠，具有良好的觀賞和生態(tài)價值。窄葉鮮卑花以葉和果穗藥用[5-6]。目前，關于窄葉鮮卑花的研究多集中于化學成分測定[6-7]，藥理作用[6-8]，但干旱脅迫對其種子萌發(fā)特性未見報道。本研究在祁連山區(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，窄葉鮮卑花雖結實量大，但在分布區(qū)常呈零星分布，成片分布較少，且實生苗密度小，植被再生能力較差，種群更新慢。目前，祁連山國家級自然保護區(qū)因生態(tài)問題突出，政府出臺了系列整治措施，嚴禁濫采亂伐，而藏區(qū)牧民常采集其枝葉和果穗用于消除腹脹，用養(yǎng)矛盾突顯。為使這一民族藥用資源永續(xù)利用，在淺山區(qū)開展馴化栽培和種群恢復意義深遠。為此，本實驗以窄葉鮮卑花種子為材料，采用不同PEG-6000水溶液模擬干旱脅迫環(huán)境來研究窄葉鮮卑花種子的萌發(fā)特性，揭示窄葉鮮卑花種子萌發(fā)特性，為野生種馴化和種群恢復提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試材料 窄葉鮮卑花蒴果于2016年10月采自祁連山區(qū)，經(jīng)度101°15′，緯度38°26′；海拔2 902.23 m。蒴果風干后脫粒、清選，得95 g種子。選擇籽粒飽滿、色澤正常的種子，用75%酒精消毒10 s，撈出后再用蒸餾水反復清洗種子，瀝去水分待用。

1.1.2 供試藥劑 PEG-6000，購自天津市致遠化學試劑有限公司。模擬干旱環(huán)境條件設0,5%,10%,15%,20%,25%,30%聚乙二醇(PEG)水溶液處理，用滲透儀測定滲透勢分別為:0,-0.05,-0.14,-0.28,-0.45,-0.69,-0.99 MPa。

1.2 方 法

1.2.1 吸水實驗 取12 cm×12 cm×5 cm的發(fā)芽盒，放入不同濃度PEG溶液潤濕發(fā)芽紙，再選取處理后的窄葉鮮卑花種子100粒點播在發(fā)芽紙上，每個處理重復4次，置于25 ℃的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。為減少蒸發(fā)和種子吸水引起培養(yǎng)皿內(nèi)發(fā)芽紙水勢的改變，3 h更換1次發(fā)芽紙和溶液。每3 h測定1次吸水量，48 h后結束吸水實驗。測定時將培養(yǎng)皿內(nèi)的種子全部取出，用濾紙吸去種子表面黏附的溶液，快速稱重，并根據(jù)公式計算種子吸脹速率：

WZ=(WT-WO)/WO×100%

式中：WZ——種子重量的增加率；WT，WO——種子吸水后、前的重量[9]。

1.2.2 PEG對種子萌發(fā)和幼苗生長的實驗 設0，5%，10%，15%，20%，25%，30%聚乙二醇(PEG)水溶液處理，以蒸餾水處理作對照(CK)，共7個處理，用標準發(fā)芽實驗方法，每個處理點播100粒種子，重復4次，在25±1 ℃下進行發(fā)芽實驗，待種子萌動后，置于25±1 ℃、光照/黑暗為14/10 h的條件下培養(yǎng)。發(fā)芽期間每天定時補水。從種子開始吸水始計時，將幼苗萌發(fā)可分為萌動、萌發(fā)、出苗3個階段[10]，因其種子很小，其標準定為：50%的種子露白達0.3 cm為萌動；50%的種子子葉突破種皮，種苗長為0.3 cm為萌發(fā)；50%的種子子葉完全展開，種苗長為0.7 cm為出苗。

1.3 種子發(fā)芽指標測定

從播種的第2天開始，每天記錄種子發(fā)芽情況，以胚根長度達種子長度相等為發(fā)芽標準，以連續(xù)3 d無種子萌發(fā)視為萌發(fā)結束。測定種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、平均發(fā)芽時間、萌發(fā)抗旱指數(shù)。

發(fā)芽指數(shù)(GI)：GI=∑Gt/Dt

式中：Gt——逐日萌發(fā)數(shù)；Dt——相應發(fā)芽的天數(shù)。

活力指數(shù)(VI)：VI=GI·S

式中：GI——發(fā)芽指數(shù)；S——幼苗的長度。

平均發(fā)芽時間(MGT)： MGT =∑(Gt·Dt)/∑Gt

式中：Gt——第t天發(fā)芽的種子數(shù)；Dt——自播種后的第幾天。

萌發(fā)抗旱指數(shù)(GDRI)： GDRI=PIS/PIC

式中：PIS——水分脅迫下種子萌發(fā)指數(shù)； PIC——對照種子萌發(fā)指數(shù)；其中，PI=1.00nd2+0.75nd4+0.50nd6+0.25nd8； nd2，nd4，nd6，nd8——第2,4,6,8 d的種子萌發(fā)率； 1.00,0.75,0.50,0.25——相應萌發(fā)天數(shù)的抗旱系數(shù)[11]。

1.4 幼苗生長指標的測定

將上述培養(yǎng)14 d的幼苗每培養(yǎng)皿隨機數(shù)取30株，測定根長、苗長、稱取苗鮮重、干重。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)應用計算機DPS程序統(tǒng)計分析實驗數(shù)據(jù)，Duncan方法進行多重比較，Graphpad prism 5軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫對窄葉鮮卑花種子吸脹速率的影響

由圖1可以看出，窄葉鮮卑花種子吸水過程表現(xiàn)出先升后降，其過程呈現(xiàn)3個階段，即急速吸水期、緩慢上升期和吸水平穩(wěn)期。置床后15 h內(nèi)為急劇吸水期，吸水率由0上升38%～70.19%；置床后15～36 h后為穩(wěn)定吸水期，吸水率從38%～70.19%上升到50%～89.15%；置床后36 h后為吸水平穩(wěn)期，吸水率維持在46%～89.15%波動。在不同處理中，種子在CK,5%,10%PEG處理下36 h達最大吸水率，分別為89.15%,78.82%,75.49%；在15%,20%,25%PEG處理下，39 h達到最大吸水率，分別為76.22%,76.21%,67.81%；在30%PEG溶液處理下，48 h達到最大吸水率，為46.78%，各處理的吸脹速率均低于對照?？傮w而言，隨PEG濃度的增加，吸脹速率表現(xiàn)出先急升，再緩慢上升，后平穩(wěn)的趨勢。

圖1 PEG滲透脅迫下窄葉鮮卑花種子在25 ℃下的累積吸水率

2.2 干旱脅迫對窄葉鮮卑花種子萌芽的影響

由表1可以看出，PEG濃度從5%增加到25%

時，發(fā)芽率由對照的94%分別下降到86.00%,62.67%,45.33%,30.67%,20.27%；PEG濃度達30%時，種子芽率為0，種子完全被抑制，與對照相比，各處理均達到極顯著水平(p<0.01)，表明窄葉鮮卑花種子的發(fā)芽率隨PEG濃度的升高而呈明顯的下降趨勢。由表1看出，隨著脅迫程度的加劇，發(fā)芽勢呈下降趨勢。在5%處理下，發(fā)芽勢比對照下降19.21%；在10%處理下，發(fā)芽勢比對照下降26.66%；在15%處理下，發(fā)芽勢下降更快，比對照下降了64%；各處理與對照相比，差異均達到極顯著水平(p<0.01)，15%與25%處理相比差異不顯著(p>0.05)。說明隨著脅迫的加劇，種子發(fā)芽的高峰期明顯滯后。從表1看出，隨著脅迫程度的加劇，種子的發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)與脅迫程度呈負相關。從5%～25%與對照相比，發(fā)芽指數(shù)分別下降了20.34%,40.50%,76.10%,86.75%和89.53%，且處理間差異達極顯著水平(p<0.01)。從5%～25%與對照相比，活力指數(shù)分別下降了42.90%,65.10%,87.93%,93.3%和64.86%，且差異達極顯著(p<0.01)。濃度為30%時，種子完全被抑制。窄葉鮮卑花種子在0,5%及10%PEG濃度處理下(表1)，第3 d開始萌發(fā)；在15%PEG處理下，第5 d開始萌發(fā)；在20%及25%PEG處理下，第6 d開始萌發(fā)，而30%PEG處理一直未見萌發(fā)。說明隨著脅迫強度增加，種子萌發(fā)時間明顯滯后，種子萌發(fā)受抑制程度加重，在高強度處理下，種子萌發(fā)受到較大程度的抑制。平均發(fā)芽日數(shù)常用來表示發(fā)芽速率。日數(shù)越小，表示發(fā)芽速度越快。由表1可以看出，隨PEG濃度的升高，各處理的平均發(fā)芽日數(shù)逐漸升高。PEG濃度為5%,10%時，與對照相比差異不顯著，說明低濃度PEG對窄葉鮮卑花的發(fā)芽速率影響很??；當PEG濃度在15%以上時，與對照間差異達極顯著水平(p<0.01)。說明高濃度PEG抑制了種子的萌發(fā)速率?？傮w來看，PEG在低濃度時對初始發(fā)芽時間和平均發(fā)芽日數(shù)影響較小，但對發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)影響較大。

表1 PEG處理對窄葉鮮卑花種子發(fā)芽的影響

注：不同大小寫字母表示差異在0.01,0.05水平顯著性。下同。

2.3 干旱脅迫對窄葉鮮卑花幼苗生長的影響

由表2可以看出，隨著PEG濃度的增加，窄葉鮮卑花根長、苗長呈下降趨勢。PEG濃度從5%增加到25%時，與對照相比，根長分別下降22.1%,51.9%,64.5%,72.6%和78.6%，苗長分別下降28.3%,41.3%,49.5%,49.6%和50.9%，各處理與對照相比差異達極顯著水平(p<0.01)。說明干旱脅迫程度與根長、苗長呈負相關，且從下降程度看，對根長的影響大于苗長。由表2可以看出，窄葉鮮卑花幼苗鮮重和干重都隨著PEG梯度的增加呈逐漸降低的趨勢。PEG濃度為5%時，與對照相比，株鮮重下降6.32%，差異達極顯著水平(p<0.01)；而干重下降5.55%，與對照相比差異不顯著(p>0.05)。當濃度為10%時，鮮重下降20.0%；干重下降22.22%，與對照相比差異達極顯著水平(p<0.01)。表明輕度干旱，對干重影響較小，對鮮重影響較大?？傮w而言，干旱脅迫使窄葉鮮卑花幼苗的生物量積累明顯下降，對鮮重的影響大于干重。實驗中還發(fā)現(xiàn)在蒸餾水處理下，幼苗生長健壯，心葉順利抽出，種皮脫離子葉；5%PEG處理下，幼苗生長健壯，心葉抽出，85%的種皮完全脫離子葉；10%PEG處理下，心葉小，50%種皮脫離子葉；15%～25%PEG處理下，幼苗弱小，萌發(fā)種子的種皮粘連子葉。

表2 PEG處理對窄葉鮮卑花幼苗生長的影響

2.4 干旱脅迫對窄葉鮮卑花種子抗旱萌發(fā)指數(shù)的影響

種子萌發(fā)抗旱指數(shù)是評價種子萌發(fā)期抗旱性的可靠指標。從圖2可以看出，隨PEG濃度增加，窄葉鮮卑花種子的萌發(fā)抗旱指數(shù)呈下降趨勢。PEG濃度在0～10%時，萌發(fā)抗旱指數(shù)呈直線式的下降；在10%～15%之間，則呈斷崖式下降，由0.633 7下降到0.076 6，PEG濃度在15%以上時，變化趨勢趨于平緩，抗旱指數(shù)在0～0.076 6之間，濃度為30%時，萌芽被完全抑制，經(jīng)回歸分析，得回歸方程為：y=0.927 3-3.702 2x(r=0.927 1)。說明PEG脅迫處理對種子萌發(fā)的延緩作用突出。

2.5 干旱脅迫下，種子萌動、萌發(fā)和出苗各階段的需水閥值研究

采用Scott[12]的方法，在正常供水條件下，種子群體萌動、萌發(fā)和出苗達50%所需時間分別為53.33，

97.33和154.33 h，經(jīng)0～30%PEG脅迫處理后，需要的時間比CK延長了6.26～579.43%，11.31～336.51%和12.60～308.27%(表3)。

圖2 不同濃度PEG處理對窄葉鮮卑花種子萌發(fā)抗旱指數(shù)的影響

環(huán)境水勢/MPa50%萌動時間/h+CK%50%萌發(fā)時間/h+CK%50%出苗時間/h+CK%053.33097.330154.330-0.0556.676.26108.3311.31173.6712.60-0.1472.3335.63153.0057.20289.00120.35-0.28123.00130.64217.00143.50453.67195.08-0.45209.00291.90353.67294.19527.33308.27-0.69362.34579.43424.86336.51——

注：+CK%=(處理達各個階段所需時間-對照達到相應階段所需時間)÷對照達到相應階段所需時間×100%。

經(jīng)擬合方程后，種子群體萌動、萌發(fā)和出苗達50%的環(huán)境臨界水勢分別為-0.715 4，-0.590 4和-0.561 9 MPa(表4)。由此表明種子在萌發(fā)過程中，對水分的需求呈增加趨勢，即對干旱的反應程度在加大，其中出苗階段對水分的要求最高。

表4 種子萌動、萌發(fā)、出苗時間與環(huán)境水勢的關系及各階段臨界水勢

注：w為水勢。

3 討 論

水分是影響農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)最主要的因素，干旱不僅制約植物的生長與產(chǎn)量，也會引起植物空間結構與功能的變化，對植物的傷害在所有非生物逆境脅迫中占首位[13]。而在種子萌發(fā)期的植物更容易受到水分脅迫等不利因素的影響，故死亡率較高，所以，種子的萌發(fā)特性以及幼苗階段的生長常被用于評價植物的抗逆性[14]。

不同的植物種子，在吸脹和萌發(fā)時對水勢的要求不同，萌發(fā)期間吸水的速度也不同。本實驗結果表明，隨PEG濃度的增加，窄葉鮮卑花種子吸脹速率表現(xiàn)出先急升后平穩(wěn)的趨勢，吸脹速率可劃分為3個階段，15 h內(nèi)為急速吸水期，15～36 h為緩慢上升期，36 h后為吸水平穩(wěn)期。種子在CK,5%,10%PEG處理下36 h達最大吸水率，在15%,20%,25%PEG處理下，39 h達到最大吸水率，在30%PEG溶液處理下，48 h達到最大吸水率，各處理的吸脹速率均低于對照，說明種子在較高水勢下快速吸水，在低水勢下緩慢吸水。由此也說明窄葉鮮卑花種子萌發(fā)對干旱有特殊的適應策略，水勢較高時，種子加速吸水，促進萌發(fā)，在低水勢下，種子通過貯藏物控制水分，延緩或阻止種子萌發(fā)，種子的萌發(fā)對水勢有較強的依賴性，這可能是窄葉鮮卑花在干旱脅迫環(huán)境中繁育的主要途經(jīng)之一。因此，種植時必須保證較高的水勢，滿足種子吸脹生理，保證良好的田間出苗率。

水分是植物生長和植被分布重要的制約因素，也是種子萌發(fā)的關鍵生態(tài)因子。徐建新等[15]的研究認為，輕度干旱脅迫，對種子的萌發(fā)有促進作用，脅迫強度增加，抑制作用增強。本研究表明，干旱脅迫推遲了種子萌發(fā)的高峰期，導致種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、活力指數(shù)、發(fā)芽指數(shù)和種子抗旱萌發(fā)指數(shù)均與PEG濃度呈負相關，且對發(fā)芽勢的影響重于發(fā)芽率。這一結論與徐建新等的研究結果有差異，而與喻澤莉等[16]和郝楠等[17]的研究結果一致。說明窄葉鮮卑花種子的萌發(fā)對水勢的要求較高，在較高水勢的環(huán)境中，種子采取了“順應”策略，而逆境時，種子采取“躲避”的策略。實驗也發(fā)現(xiàn)，隨著脅迫的加劇，發(fā)芽高峰期明顯滯后，且發(fā)芽勢比發(fā)芽率敏感，這與孫霞等[18]在木藍上的研究一致，說明隨干旱強度的增加，導致種子內(nèi)部傷害嚴重，抑制了活性酶和激素代謝的變化。

關于幼苗生長對干旱脅迫對的響應，王進[9]認為，干旱對苦豆子(Sophoraalopecuroides)根長和苗高有抑制作用，但對幼苗根干重有促進作用；而楊旭東[19]通過向日葵(Helianthusannuus)實驗認為，幼苗根長、苗長、鮮重、干重隨PEG濃度的增加均呈下降趨勢。本實驗研究結果與楊旭東的研究相近，在苗干重上與王進的研究結論不同，這可能與種子特性及生境有關。由此說明，隨著脅迫加劇，導致幼苗生長緩慢，不利于幼苗的生物量積累。從干旱對根長的影響大于苗長的結果看，說明幼苗對干旱有特殊適應機制，主要是通過控制地下部分來緩解輕度干旱對其幼苗的傷害。

吸水是種子萌發(fā)的先決條件，充足的水分供應是種子吸脹萌發(fā)的保征。本實驗結果表明，在水分充足的條件下，種子3 d就開始發(fā)芽，但隨脅迫的加重，種子的發(fā)芽初始時間明顯推遲2～3 d(或更多)，平均發(fā)芽日數(shù)延長1～5 d。說明種子萌發(fā)是通過滲透調(diào)節(jié)來適應干旱生境，PEG濃度越高越不利于窄葉鮮卑花種子的吸水和萌芽，也說明了窄葉鮮卑花雖株種子量巨大，呈明顯的“種子雨”特征，且在適宜條件下芽率達94%，但種子萌發(fā)表現(xiàn)出典型的“機會主義”傾向，部分種子雖萌發(fā)，但種子瘦小，若供給不足，常又自生自滅，這較好地解釋了窄葉鮮卑花分布區(qū)常呈零星分布，實生苗稀少，而濕度大、降水多的陰坡卻呈片狀分布的特點。

4 結 論

隨著脅迫程度的加劇，窄葉鮮卑花種子的吸水過程表現(xiàn)出急速吸水期、緩慢上升期和吸水平穩(wěn)期3個階段；其發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)和種子抗旱萌發(fā)指數(shù)及苗高、根長，苗重與脅迫強度均呈負相關關系。當PEG濃度達30%時，種子萌發(fā)完全被抑制。種子群體萌動、萌發(fā)和出苗達50%的環(huán)境臨界水勢分別為-0.715 4,-0.590 4和-0.561 9 MPa。由此說明，干旱脅迫顯著抑制了窄葉鮮卑花種子的萌發(fā)和幼苗生長，也說明水分是窄葉鮮卑花種子萌發(fā)和幼苗形成的主導因素之一，在較干旱地區(qū)種植需要考慮水分的供給。