徐 碩,姜文清,鄺詠梅,徐文峰,金鵬飛
(北京醫(yī)院藥學部,國家老年醫(yī)學中心,藥物臨床風險與個體化應(yīng)用評價北京市重點實驗室,北京 100730)
斑馬魚(zebrafish)又名藍條魚、花條魚和斑馬擔尼魚等,是一種熱帶觀賞魚,體長4~6 cm,屬鯉科短擔尼爾屬,原產(chǎn)于印度、孟加拉。自1994年冷泉港集會以及Nature和Science等雜志發(fā)表專題評述,到2009年斑馬魚全基因組測序完成,斑馬魚已成為一種公認的新型模式生物。
與線蟲、果蠅和鼠等其他模式生物相比,斑馬魚與人的器官在結(jié)構(gòu)、生理和分子水平等方面相似性極高,和人類的基因組保守性很高,在蛋白質(zhì)水平上,關(guān)鍵部位的同源性幾乎是100%。國內(nèi)外利用斑馬魚及其突變體已建立了多種人類疾病模型[1-3],并開展了相關(guān)的藥物篩選評價研究工作。
從腫瘤生物學角度來看,斑馬魚和人的腫瘤在組織學上非常相似;兩者腫瘤均具有遺傳性;人和斑馬魚的基因序列相比較,二者在細胞周期基因、腫瘤抑制基因和癌基因等方面均具有保守性。斑馬魚的胚胎特征與腫瘤相似,具有細胞分裂速度快、細胞凋亡速度延緩和血管生成能力旺盛等特點。本文對近年來斑馬魚模型在抗腫瘤活性篩選中的應(yīng)用研究進行綜述。
1.1化學誘導致癌模型 Beckwith L G等[4]通過利用乙基亞硝基脲(ENU)處理,致使斑馬魚患皮膚癌,在大于1 mm的腫瘤里可觀察到血管新生。Lam S H等[5]對人及斑馬魚肝臟腫瘤的 microarray數(shù)據(jù)進行比較,發(fā)現(xiàn)導致癌癥發(fā)生的基因是保守的。常用致癌物亞硝基胍(MNNG)和9,10-二甲基-1,2-苯并蒽(DMBA)易導致斑馬魚胚胎腫瘤的發(fā)生[5-7]。
1.2基因突變模型 相比于野生型斑馬魚,抑癌基因失活的斑馬魚腫瘤發(fā)病率較高。Tp53是十分重要的抑癌基因,50%以上的腫瘤患者體內(nèi)會發(fā)生該基因的突變[8]。Berghmans S等[9]利用靶向選擇性突變技術(shù),建立了一個在Tp53的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域存在錯配突變的斑馬魚突變體。純合的Tp53突變體在8.5個月出現(xiàn)神經(jīng)鞘腫瘤,另一個腫瘤抑制基因是結(jié)腸腺瘤息肉基因(APC),為Wnt通路的重要組分[10]。因為APC發(fā)生突變常導致結(jié)腸腫瘤患者的Wnt通路被異常激活。Hurlstone A F L等[11]在篩選ENU突變的斑馬魚時發(fā)現(xiàn)了一個APC突變體,受精后96 h,純合的APC突變體死亡。雜合的APC突變體在胚胎期發(fā)育正常,但15個月后,腸道、肝臟和胰腺腫瘤發(fā)生于大多數(shù)胚胎[12],并伴有高表達Wnt靶基因以及β-catenin 的累積,這些特征與人結(jié)腸腫瘤具有一致性。
1.3基因組改造模型 特定基因的活性上調(diào)而導致的腫瘤很適合采用轉(zhuǎn)基因斑馬魚進行研究。通過構(gòu)建由斑馬魚rag2啟動子驅(qū)動小鼠c-myc與GFP的融合基因(zRag2-EGFP-mMyc),或是單獨的小鼠c-myc基因(zRag2-mMyc)的轉(zhuǎn)基因品系,能使人T淋巴細胞白血病(T-ALL)的發(fā)病過程得到模擬[13]。zRag2-EGFP-mMyc的平均潛伏期是52 d。zRag2-mMyc 的平均潛伏期是44 d。在潛伏期之后,白血病由胸腺部位逐漸蔓延至腮弓、眼球后軟組織、骨骼肌及腹部組織。表達GFP的白血病細胞在移植后,依然能導致接受過放射的斑馬魚患上T-ALL。對該T-ALL模型做進一步改造,利用Cre-loxp系統(tǒng)使c-myc的表達得到控制[14]。
1.4移植模型 采用腫瘤細胞移植的方法能夠建立某些腫瘤的斑馬魚模型。崔戈等[15]分別構(gòu)建BAMBI過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細胞株SW620(BAMBI+組)、空載體紅色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細胞株SW620(EV組),分別顯微注射到受精后第2天轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(Apo14∶GFP)胚胎卵黃囊,激光共聚焦熒光顯微鏡觀察,用ImageJ軟件測量轉(zhuǎn)移至斑馬魚肝臟內(nèi)結(jié)腸癌細胞的紅色熒光表達強度。結(jié)果表明,相比于EV組,激光共聚焦熒光顯微觀察顯示BAMBI+組斑馬魚肝內(nèi)結(jié)腸癌細胞紅色熒光表達量顯著增加;BAMBI+組斑馬魚肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率也明顯增加。構(gòu)建的基因修飾人結(jié)腸癌細胞移植斑馬魚致肝轉(zhuǎn)移模型,可較好地模擬活體狀態(tài)的結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移;BAMBI基因能促進異種移植入斑馬魚的結(jié)腸癌細胞發(fā)生肝轉(zhuǎn)移。
劉軍秀等[16]利用線性化的紅色熒光質(zhì)粒pcDNA3.0+DsRed轉(zhuǎn)染人宮頸癌SiHa 細胞,通過顯微注射法將穩(wěn)定表達紅色熒光的SiHa細胞移植入48 hpf(發(fā)育后時數(shù))的FLK轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎內(nèi),建立了人宮頸癌斑馬魚模型。結(jié)果顯示注射不同數(shù)量人宮頸癌SiHa細胞能不同程度地影響斑馬魚卵,產(chǎn)生最佳促進血管新生作用的是注射50~100個細胞。注射Matrigel的對照組斑馬魚,在注射后的第1和第2天突出到腸下靜脈血管籃外到卵黃的垂直分枝平均血管數(shù)頻率分別為2.8%±1.4%和5.4%±2.2%。而注射SiHa細胞的斑馬魚新生血管數(shù)明顯高于對照組,在注射后第1和第2天突出到腸下靜脈血管籃外到卵黃的垂直分枝平均血管數(shù)頻率分別為8.0%±2.7%和27.4%±3.2%。
2.1在天然產(chǎn)物或中藥活性篩選中的應(yīng)用 大量研究顯示,多種腫瘤(包括實體瘤和血液腫瘤)的生成、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和預(yù)后都與腫瘤血管生成密切相關(guān)。夏小艷等[17]采用斑馬魚模型,測定靛玉紅的抑制血管生成活性。結(jié)果表明,質(zhì)量濃度為10和50 mg·L-1可明顯抑制斑馬魚胚胎體節(jié)間血管生成,抑制率為20.9%。
楊大松等[18]從土黨參(金錢豹Campanumoeajavanica的根)90%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位中分離得到14個化合物,采用斑馬魚胚胎模型對其抗血管生成活性進行評價。結(jié)果顯示,4E,8E,12E-三烯-10-炔-1,6,7-十四烷三醇(3)和9-(2-四氫吡喃)-8E-烯-4,6-二炔-3-壬醇(4)在質(zhì)量濃度為50 μg·mL-1時對斑馬魚節(jié)間血流具有明顯的抑制作用,化合物3與4抗斑馬魚血管生成的EC50分別為136.38和68.70 μg·mL-1。
林風等[19]對海洋小單胞菌產(chǎn)生的縮肽類化合物rakicidins的體內(nèi)外抗腫瘤活性進行了研究。結(jié)果顯示,Rakicidin B1、A和B對人結(jié)腸癌(HCT-8)細胞的增殖具有明顯的抑制作用,在乏氧培養(yǎng)條件下的抑制作用更強,與在常氧條件下相比,分別為各自的15,26和14倍。利用移植人結(jié)腸癌HCT-8腫瘤斑馬魚模型,測試了體內(nèi)抗腫瘤活性,化合物B和B1可明顯抑制腫瘤生長。王榮春等[20]通過將SiHa細胞注入48 hpf的斑馬魚胚胎卵黃囊,建立斑馬魚移植瘤模型,采用細胞增殖實驗(MTT)測定蘆薈大黃素(AE)在不同質(zhì)量濃度下對人宮頸癌細胞SiHa生長的抑制作用。結(jié)果表明,AE質(zhì)量濃度為1.0和0.5 μg·mL-1時可抑制斑馬魚移植瘤的增殖和轉(zhuǎn)移,MTT法顯示,AE對SiHa細胞的生長具有明顯抑制作用,表現(xiàn)出一定的質(zhì)量濃度-時間-效應(yīng)依賴關(guān)系。
黃志軍等[21]在斑馬魚卵黃囊內(nèi)植入熒光標記的人乳腺癌(MCF-7)細胞,建立了移植瘤模型,采用該模型探討小金膠囊(麝香、木鱉子、制草烏和楓香脂等10味中藥組成)的抗腫瘤作用,對新生血管形成的抑制作用的觀察是利用轉(zhuǎn)基因斑馬魚。結(jié)果顯示,小金膠囊在質(zhì)量濃度為26.47,88.24和264.72 μg·mL-1時對斑馬魚MCF-7移植瘤的抑制率分別為31.66%,54.35%和53.77%,在質(zhì)量濃度為264.72 μg·mL-1時可明顯抑制血管形成和誘導細胞凋亡,抑制率和誘導率分別是21.74% 和28.92%。
韓利文等[22]以TG(VEGFR2∶GFP)系血管熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚和AB系斑馬魚為模型,分別用單體成分靛玉紅、虎杖提取物、長春花提取物和西黃丸處理斑馬魚胚胎,考察對斑馬魚胚胎血管生成的影響。結(jié)果顯示,靛玉紅在質(zhì)量濃度為50 μg·mL-1時能顯著抑制斑馬魚節(jié)間血管的生成;虎杖、長春花乙酸乙酯提取物分別在質(zhì)量濃度為10和100 μg·mL-1對斑馬魚血管生成具有明顯抑制作用;西黃丸溶液質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1時抑制血管生成作用與對照組相比具有顯著差異。
2.2在化學藥物篩選中的應(yīng)用 呂文文等[23]采用斑馬魚模型,考察了化合物的體內(nèi)抗腫瘤血管生成活性。結(jié)果N-芐基-4,6-二甲氧基鄰苯二甲酰亞胺和N-芐基-4,6-二羥基鄰苯二甲酰亞胺可明顯抑制人肺腺癌A549細胞中血管內(nèi)皮生長因子的分泌,并對斑馬魚體節(jié)間血管的生成有明顯抑制作用。
于歌等[24]用不同質(zhì)量濃度鹽酸多西環(huán)素(Dox)對斑馬魚胚胎進行處理,誘導其肝臟異常增生,利用毒性作用及綜合評價誘導效應(yīng),用來確定適合的誘導質(zhì)量濃度,對索拉非尼抑制肝部異常增生的能力進行研究。結(jié)果表明,Dox的最適誘導質(zhì)量濃度是60 mg·L-1,索拉非尼能明顯抑制斑馬魚模型的肝部異常增生。
2.3在中西藥聯(lián)用抗腫瘤中的應(yīng)用 薛迪等[25]采用的實驗?zāi)P蜑?4 hpf(hour post fertilization,hpf)健康TG(VEGFR2∶GFP)系血管熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚,分別用復(fù)方苦參注射液、順鉑及其兩藥合用處理24 h,以節(jié)間血管作為檢測指標,用SPSS軟件對實驗數(shù)據(jù)做統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示,順鉑質(zhì)量濃度為50和100 μg·mL-1時對節(jié)間血管有明顯的抑制作用,質(zhì)量濃度為5 000 μg·mL-1的復(fù)方苦參注射液抑制節(jié)間血管作用明顯,兩藥合用時比單用具有更明顯的抑制效果。
斑馬魚與人類基因組學的相似度達到87%,心血管、神經(jīng)和代謝系統(tǒng)的解剖結(jié)構(gòu)、生理、分子生理學特征與哺乳動物相似性高,是一種理想的動物模型,運用斑馬魚能進行大規(guī)模藥物篩選。該模型能避免細胞和化學篩選模型的局限性,從整體水平直觀地評估藥物的治療作用、不良反應(yīng)和毒性作用等。有報道近期美國科學家成功培育出一種透明斑馬魚,人們能夠直視這種斑馬魚的內(nèi)部器官,實時觀測活體器官中的腫瘤以及其他各類腫瘤的生長過程,這類新培育出的斑馬魚會在整個生命過程中保持透明狀態(tài)[26]。斑馬魚生物模式可作為一個系統(tǒng)的生物學應(yīng)用于藥物開發(fā),也可將斑馬魚發(fā)育毒理或?qū)嶒災(zāi)P陀糜诨衔锏亩拘院Y選中[27-28]。
斑馬魚在新藥發(fā)現(xiàn)的應(yīng)用有一定局限性,如目前仍缺少能夠重現(xiàn)人類疾病機制的斑馬魚模型。對于中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究是發(fā)現(xiàn)新藥的重要途徑之一,通過對有效成分的結(jié)構(gòu)改造,有可能發(fā)現(xiàn)更多高效低毒的先導化合物[29]。利用斑馬魚作為藥物篩選模型尚處于發(fā)展階段,但已顯示出巨大的潛力。相信在科學家們的共同努力下,斑馬魚模型在藥物抗腫瘤活性篩選中的應(yīng)用研究會越來越深入,將發(fā)現(xiàn)更多新的活性化合物,對這些活性成分的研究也會不斷加深人們對生命現(xiàn)象的認識。
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