顏 衛(wèi)， 趙莎莎， 盧勁曄， 羊建平， 沈曉鵬， 蔣珊珊

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300)

彎曲菌是一種重要的人獸共患病原菌，不僅可以引起動(dòng)物腹瀉、牛羊流產(chǎn)、雛雞壞死性肝炎，它也是全球范圍內(nèi)引起人胃腸道感染最常見(jiàn)的病原菌，可引起人類發(fā)熱、急性腸炎、格林巴利綜合征等，兒童、老人和免疫缺陷癥病人是彎曲菌感染的高危人群，嚴(yán)重時(shí)可引起死亡。該菌廣泛分布于自然界，是許多畜禽的寄生菌，可通過(guò)動(dòng)物、食物、水等傳播并引起人類感染，肉類、蔬菜、水等均存在不同程度的彎曲菌污染，對(duì)該菌的流行現(xiàn)狀監(jiān)測(cè)對(duì)于食品安全、公共衛(wèi)生有重要意義。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基與試劑

布氏肉湯、Carry-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基，購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；CCDA購(gòu)自O(shè)XOID公司，Buffer、dNTPs、Taq酶、低分子量DNA marker，購(gòu)自大連寶生物工程公司；微氧產(chǎn)氣袋購(gòu)自MGC公司；綿羊全血購(gòu)自蘭州民海生物工程有限公司?？股鼗旌弦海憾囵ぞ谺、甲氧芐氨嘧啶、利福平各 0.125 g，放線菌酮1.250 g，加入25 mL丙酮蒸餾水混合液(1 ∶1 比例混合)溶解過(guò)濾后備用。彎曲菌生長(zhǎng)促進(jìn)劑：硫酸亞鐵、焦亞硫酸鈉、丙酮酸各稱取1.563 g，加入25 mL蒸餾水充分溶解，過(guò)濾備用。布氏肉湯高壓滅菌，冷卻后分別加入抗生素混合液和彎曲菌生長(zhǎng)促進(jìn)劑搖勻備用(200 mL中加入 1 mL)。CCDA配制完高壓滅菌后，冷卻至50～60 ℃加入頭孢哌酮(32 mg/L)和兩性霉素B(10 mg/L)。

1.2 樣品來(lái)源

2016年6月至2017年5月陸續(xù)采集醫(yī)院腹瀉病人(包括門診部和住院部)糞便樣本、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和超市食品樣本、環(huán)境樣本、動(dòng)物源肛拭樣本(包括規(guī)?；︷B(yǎng)雞、散養(yǎng)雞、市場(chǎng)雞、養(yǎng)殖場(chǎng)鴨群、養(yǎng)殖場(chǎng)鵝群)共868份進(jìn)行彎曲菌的檢測(cè)。

1.3 彎曲菌的分離

肛拭樣品、腹瀉患者送檢的糞便樣品插入Carry-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基中于12 h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。食品、環(huán)境樣品采集后置于4 ℃冰盒送實(shí)驗(yàn)室立即檢測(cè)。取肉類、蔬菜樣品1 g剪碎，污水樣品1 mL，Carry-Blair培養(yǎng)基中取出的棉拭加入9 mL布氏肉湯(含抗生素和生長(zhǎng)促進(jìn)劑)，厭氧培養(yǎng)罐(加入微需氧產(chǎn)氣袋后立即密封)42 ℃搖床培養(yǎng)24 h，菌液接種CCDA平板，42 ℃培養(yǎng)箱(含10% CO2)培養(yǎng)24～48 h，選取濕潤(rùn)、灰白色，有金屬光澤菌落3～5個(gè)，溶于50 μL超純水，隔水煮沸20 min后取出置于冰上，8 000 r/min離心5 min，取上清進(jìn)行PCR檢測(cè)。

1.4 彎曲菌的鑒定

參照何蕊等的方法[1]，選取彎曲菌屬16S rRNA基因、空腸彎曲菌mapA基因、結(jié)腸彎曲菌CeuE基因設(shè)計(jì)引物。PCR體系中各成分的量為：10×Buffer 2.5 μL，dNTPs 3 pmol，16S rRNA的引物分別為20 pmol，mapA引物、CeuE引物各為 37.5 pmol，模板溶液2 μL，Taq酶0.2 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，59 ℃ 90 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

空腸彎曲菌標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)多重PCR擴(kuò)增，在857、589 bp處分別出現(xiàn)屬特異性條帶和種特異性條帶；結(jié)腸彎曲菌經(jīng)PCR擴(kuò)增，在857、462 bp處分別出現(xiàn)屬特異性條帶和種特異性條帶。

2 結(jié)果與分析

2.1 人源樣本彎曲菌的監(jiān)測(cè)結(jié)果

本試驗(yàn)采集的183份腹瀉患者糞便樣本中有10份檢測(cè)出空腸彎曲菌，陽(yáng)性率5.46%，有1份檢測(cè)出結(jié)腸彎曲菌，陽(yáng)性率0.55%。147份5歲及以下嬰幼兒樣品中有10份樣品檢測(cè)出彎曲菌陽(yáng)性，陽(yáng)性率6.80%，其中9份樣品為空腸彎曲菌陽(yáng)性，陽(yáng)性率6.12%，1份樣品為結(jié)腸彎曲菌陽(yáng)性，陽(yáng)性率0.68%；36份6歲及以上腹瀉患者樣品中檢測(cè)出1份空腸彎曲菌陽(yáng)性，陽(yáng)性率2.78%(表1)。6—8月份的68份樣品中，檢測(cè)出6份彎曲菌陽(yáng)性，陽(yáng)性率8.82%，其中5份空腸彎曲菌陽(yáng)性，1份結(jié)腸彎曲菌陽(yáng)性，陽(yáng)性率分別為7.35%、1.47%，9—11月份采集的56份腹瀉患者樣品中有4份檢測(cè)出空腸彎曲菌，陽(yáng)性率7.14%，12月至第2年2月份的31份患者樣品中檢測(cè)到1份空腸彎曲菌陽(yáng)性，陽(yáng)性率3.23%，3—5月份的樣品未檢測(cè)到彎曲菌(表2)。來(lái)源于醫(yī)院門診的132份樣品中，彎曲菌陽(yáng)性率7.58%，其中空腸彎曲菌陽(yáng)性樣品9份，陽(yáng)性率6.82%，結(jié)腸彎曲菌陽(yáng)性樣品1份，陽(yáng)性率0.76%，來(lái)源于醫(yī)院住院部的51份樣品中，僅1份檢測(cè)出空腸彎曲菌，陽(yáng)性率1.96%(表3)。

表1 不同年齡人源樣品彎曲菌監(jiān)測(cè)結(jié)果

表2 不同時(shí)期人源樣品彎曲菌監(jiān)測(cè)結(jié)果

表3 不同采樣地點(diǎn)人源樣品彎曲菌監(jiān)測(cè)結(jié)果

2.2 動(dòng)物源樣本彎曲菌的監(jiān)測(cè)結(jié)果

采集養(yǎng)殖場(chǎng)鴨群樣本59份，檢測(cè)出空腸彎曲菌陽(yáng)性2份，陽(yáng)性率3.39%，未檢測(cè)到結(jié)腸彎曲菌。采集養(yǎng)殖場(chǎng)鵝群樣本56份，檢測(cè)出空腸彎曲菌陽(yáng)性7份，陽(yáng)性率12.50%，未檢測(cè)到結(jié)腸彎曲菌。224份雞群樣品中，檢測(cè)出彎曲菌陽(yáng)性樣品33份，陽(yáng)性率14.73%，其中空腸彎曲菌陽(yáng)性32份，結(jié)腸彎曲菌陽(yáng)性1份，陽(yáng)性率分別為14.29%、0.45%。不同來(lái)源的樣本彎曲菌感染率差異顯著。散養(yǎng)雞樣品空腸彎曲菌陽(yáng)性率為6.25%，規(guī)?；︷B(yǎng)條件下的雞群樣品空腸、結(jié)腸彎曲菌陽(yáng)性率分別為14.56%、0.97%，分離自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的雞源樣品空腸彎曲菌陽(yáng)性率達(dá)22.81%(表4)。不同時(shí)期雞源樣品的監(jiān)測(cè)結(jié)果，污染率最高的是6—8月，達(dá)21.98%(表5)。

表4 不同采樣點(diǎn)雞源樣品彎曲菌監(jiān)測(cè)結(jié)果

表5 不同時(shí)期雞源樣品彎曲菌監(jiān)測(cè)結(jié)果

2.3 食源樣本彎曲菌的監(jiān)測(cè)結(jié)果

共采集市場(chǎng)食物、污水及超市冷凍雞肉346份，彎曲菌陽(yáng)性率4.91%，監(jiān)測(cè)結(jié)果見(jiàn)表6，共檢測(cè)到13份空腸彎曲菌陽(yáng)性，陽(yáng)性率3.76%，其中污染率最高的為市場(chǎng)鮮雞肉樣品，達(dá)到10.98%，豬肉和蔬菜樣品未檢測(cè)到陽(yáng)性。346份食源樣品檢出結(jié)腸彎曲菌陽(yáng)性4份，陽(yáng)性率1.16%，冷凍雞肉未檢測(cè)到陽(yáng)性。

表6 食源樣品彎曲菌監(jiān)測(cè)結(jié)果

3 討論

彎曲菌是一種重要的食源性人獸共患病原菌，在自然界分布廣泛，寄生在多種動(dòng)物如禽類、牛羊、寵物犬體內(nèi)[2]。該菌已經(jīng)成為最重要的腹瀉病原菌之一，尤其引起嬰幼兒腹瀉[3]。來(lái)源于醫(yī)院腹瀉患者的人源樣本共采集了183份，彎曲菌陽(yáng)性樣品11份，陽(yáng)性率6.01%，其中空腸彎曲菌陽(yáng)性10份，陽(yáng)性率5.46%，結(jié)腸彎曲菌陽(yáng)性1份，陽(yáng)性率0.55%。人源樣本中有147份為5歲及以下嬰幼兒患者樣品，彎曲菌的感染率最高，達(dá)到6.80%，其中空腸、結(jié)腸彎曲菌的陽(yáng)性率分別為6.12%、0.68%，而6歲及以上患者的36份樣品感染率僅為2.78%，空腸、結(jié)腸彎曲菌的陽(yáng)性率分別為2.78%和0.00%，這就提示了5歲及以下兒童是彎曲菌的主要感染者或者是帶菌者，5歲及以下兒童可能是彎曲菌的宿主，在彎曲菌病流行過(guò)程中充當(dāng)傳染源的角色。不同時(shí)期人源樣本彎曲菌的監(jiān)測(cè)結(jié)果提示，夏季(6—8月)、秋季(9—11月)彎曲菌的感染率顯著高于其他時(shí)期，達(dá)到高峰。不同來(lái)源的人源樣本統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，醫(yī)院門診部的感染率顯著高于住院部的感染率，這可能是因?yàn)殚T診部病例尚未使用抗生素治療，住院部病例在收集樣品前已經(jīng)使用相關(guān)抗生素。

分子流行病學(xué)研究表明，人類彎曲菌主要來(lái)源于家禽，尤其是雞群。不同時(shí)期雞源樣品彎曲菌監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示出了季節(jié)性，夏季是高峰期，季節(jié)性模式表明氣候因素對(duì)動(dòng)物群體中彎曲菌的流行起著直接或間接的作用。溫度在13～20 ℃時(shí)雞群中彎曲菌感染率迅速增加，隨著溫度的進(jìn)一步升高，感染率會(huì)在較高水平上有較小的增加，因此春季后雞群中彎曲菌的感染率增加顯著，本試驗(yàn)的監(jiān)測(cè)結(jié)果也提示雞群中夏季彎曲菌的陽(yáng)性率顯著高于秋季。此外，世界范圍內(nèi)彎曲菌病的發(fā)病率同樣具有很強(qiáng)的季節(jié)性，尤其是北歐國(guó)家。

食品禽肉中的彎曲菌主要來(lái)源于雞群，減少養(yǎng)殖環(huán)節(jié)彎曲菌的感染率是控制禽肉產(chǎn)品中彎曲菌的重要前提，雞群中彎曲菌的來(lái)源及影響菌體定殖的因素主要包括其他動(dòng)物(家畜、蒼蠅、寵物等)、飼養(yǎng)人員、環(huán)境、設(shè)備、飲用水等。牛被認(rèn)為是雞群彎曲菌的可能來(lái)源。彎曲菌在牛和肉雞之間存在間歇性的雙向傳播[4]。蒼蠅可能是雞群中彎曲菌引入的載體，感染有彎曲菌的蒼蠅在夏季通過(guò)通風(fēng)進(jìn)入雞舍，有研究證明在雞舍通風(fēng)入口處使用滅蠅設(shè)備可以避免夏季彎曲菌感染率高峰期的出現(xiàn)[5]。飼養(yǎng)人員及設(shè)備被認(rèn)為是引起雞群彎曲菌傳播的危險(xiǎn)因素，飼養(yǎng)員在工作過(guò)程中應(yīng)該遵守生物安全程序，如洗手洗澡、不同雞舍不交叉使用靴子、浸泡鞋子、更換鞋子和外衣、雞舍保持整體的清潔等。此外，運(yùn)輸包裝箱也需要定期浸泡消毒液徹底消毒。雞腸道內(nèi)彎曲菌的大量存在會(huì)造成屠宰過(guò)程中的交叉污染，給食品安全造成巨大隱患，有必要在屠宰加工前對(duì)雞群進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性雞群和陰性雞群分開(kāi)屠宰。

屠宰加工過(guò)程中，糞便清除、脫毛、內(nèi)臟取出等環(huán)節(jié)可能導(dǎo)致糞粒對(duì)于食品的污染，這些環(huán)節(jié)是食品安全的關(guān)鍵控制點(diǎn)。有研究指出，使用特殊的真空裝置可減少內(nèi)臟去除環(huán)節(jié)腸內(nèi)容物泄露造成的交叉污染[6]。冷空氣預(yù)冷代替浸泡和旋轉(zhuǎn)預(yù)冷可以避免預(yù)冷產(chǎn)生的交叉污染。彎曲菌對(duì)溫度、氧氣、滲透壓等較為敏感，采取適當(dāng)?shù)臍⒕胧┛捎行Ы档颓萑獗砻鎻澢奈廴舅?，如在屠宰加工過(guò)程中使用消毒劑處理禽肉胴體，用消毒劑消毒冷藏車、屠宰洗滌池等，此外冷凍處理法也是一種實(shí)用且有效的方法，彎曲菌對(duì)低溫較為敏感，低于30 ℃便不再生長(zhǎng)，低溫儲(chǔ)存、運(yùn)輸是降低肉品表面彎曲菌數(shù)量的有效措施。

本試驗(yàn)采集的346份食源樣本，空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌的陽(yáng)性率分別為3.76%、1.16%?？漳c彎曲菌對(duì)食品和環(huán)境的污染高于結(jié)腸彎曲菌，說(shuō)明食品和環(huán)境中彎曲菌的污染以空腸彎曲菌為主。超市冷凍雞肉彎曲菌2.38%的污染率低于市場(chǎng)雞肉12.20%的污染率，主要是由于彎曲菌在冷凍條件下生存能力急劇下降。市場(chǎng)生雞肉樣品中空腸彎曲菌的污染率顯著高于其他樣品，進(jìn)一步提示雞肉是引起人類彎曲菌感染最主要的食源性傳染源，因此加強(qiáng)禽類及禽肉產(chǎn)品的食品安全管理是控制彎曲菌感染的重要環(huán)節(jié)。市場(chǎng)蔬菜和污水中彎曲菌的污染往往由動(dòng)物性食品或動(dòng)物糞便引起。豬肉樣品中結(jié)腸彎曲菌污染率高于空腸彎曲菌，提示豬肉產(chǎn)品中的污染以結(jié)腸彎曲菌為主的可能，當(dāng)然這還需要更大樣本的數(shù)據(jù)支撐。

鑒于食品尤其是肉制品中彎曲菌的污染情況，在肉品消費(fèi)階段可以采取一些措施控制污染，如生肉、熟肉分開(kāi)存放，切割生肉時(shí)使用單獨(dú)的砧板等。另外，對(duì)食物進(jìn)行熱處理也是一個(gè)最常用的避免污染的方法。烹飪食品時(shí)，食品內(nèi)部溫度達(dá)到70 ℃并維持2 min以上，或內(nèi)部溫度達(dá)到65 ℃維持10 min以上可以殺死包括彎曲菌在內(nèi)的絕大多數(shù)病原菌。食物高壓處理、氣溶膠食品包裝技術(shù)也都能達(dá)到消毒的目的。