徐志榮， 魏賽金

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院/江西省農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)與利用工程實驗室，江西南昌 330045)

南方紅豆杉(Taxuschinensisvar.mairer)別稱紫杉，為紅豆杉科(Taxaceae)紅豆杉屬(Taxus)植物，其樹皮中含有的紫杉醇是一種二萜類物質(zhì)，對治療肺癌、卵巢癌等有特定效果[1]。紫杉醇是一種植物次生代謝產(chǎn)物，以其高效、低毒及獨特的抗癌機制得到了人們的青睞。紫杉醇主要是從紅豆杉科紅豆杉屬植物的樹皮中分離、純化得到的，然而其天然資源極其有限，藥源嚴(yán)重短缺[2]。

紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)法是解決紫杉醇藥源緊缺的一種很有前途的方法。培養(yǎng)過程中利用生物或非生物誘導(dǎo)處理細(xì)胞株，可以有效地促進紅豆杉細(xì)胞合成紫杉醇。目前，誘導(dǎo)已經(jīng)成為植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)中提高次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)量的最有效的方法之一[3]，不僅是植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物的重要手段，而且在縮短工藝時間、提高容器最大利用率方面的作用也非常明顯[4]。然而，細(xì)胞次生代謝強度受到多種環(huán)境因素的影響，其中碳源是重要的一方面。培養(yǎng)基中的蔗糖大部分被降解成葡萄糖和果糖，蔗糖、葡萄糖和果糖的消耗和吸收呈現(xiàn)波動性，其中葡萄糖有利于細(xì)胞的前期生長以獲得大量的生物量，果糖有利于細(xì)胞培養(yǎng)后期紫杉烷類化合物的合成[5]。前期研究表明，真菌誘導(dǎo)子在懸浮培養(yǎng)南方紅豆杉細(xì)胞生產(chǎn)紫杉醇中具有良好的誘導(dǎo)效果。為了在反應(yīng)器中提高外源真菌誘導(dǎo)子的誘導(dǎo)效應(yīng)，本試驗通過果糖補料對南方紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系中生理狀態(tài)變化的研究，探索紅豆杉細(xì)胞放大培養(yǎng)的有效調(diào)控手段。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紅豆杉愈傷組織：以南方紅豆杉一年生枝條為外植體誘導(dǎo)獲得，傳至5代以上。真菌DF：為筆者所在實驗室自行分離保存的真菌。

1.2 試驗方法

1.2.1 細(xì)胞種子液的制備 將愈傷組織接種于含有新鮮B5液體培養(yǎng)基[6]的三角瓶中，細(xì)胞接種量為5 g/瓶，裝液量為50 mL/500 mL，接種量為10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，于(24±1) ℃、120 r/min、黑暗條件下振蕩培養(yǎng)7 d，作為細(xì)胞種子液。

1.2.2 真菌誘導(dǎo)子的制備 參照蘭文智等的酸解法制備真菌誘導(dǎo)子[7]。收集真菌DF菌體于研缽中，充分研磨，加適量水并調(diào)節(jié)pH值至2.0，于121 ℃高壓滅菌1 h，過濾收集濾液并調(diào)節(jié)pH值至5.8，即為誘導(dǎo)子。誘導(dǎo)子濃度以總糖含量計算，總糖含量以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)，采用蒽酮-硫酸比色法[8]測定。

1.2.3 5 L反應(yīng)器培養(yǎng)體系 采用5 L機械攪拌氣升式玻璃反應(yīng)器(上海百侖生物科技有限公司)，裝2.0 L B5液體培養(yǎng)基(含0.8 mL/L泡敵)，接入細(xì)胞種子液，接種量為10%(體積分?jǐn)?shù))，反應(yīng)器培養(yǎng)溫度條件為(24±1) ℃，攪拌轉(zhuǎn)速為 60 r/min，通氣量為1 L/min。在細(xì)胞培養(yǎng)8 d時加入10%果糖培養(yǎng)基(體積分?jǐn)?shù)，將蔗糖換成等質(zhì)量果糖，其他成分與B5液體培養(yǎng)基相同)和質(zhì)量濃度為100 μg/mL的真菌誘導(dǎo)子，以只添加質(zhì)量濃度為100 μg/mL的真菌誘導(dǎo)子為對照，每天取樣檢測。

1.3 項目測定

1.3.1 細(xì)胞活力的測定 用2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)法[9]測定細(xì)胞活力。抽濾除去培養(yǎng)基，取0.1 g紅豆杉細(xì)胞，加5.0 mL 0.2%TTC溶液(用0.1 mol/L pH值=7.0的磷酸緩沖液配制)，于24 ℃黑暗放置24 h，離心去上清，加入5 mL蒸餾水洗滌細(xì)胞2次后加入5 mL 95%乙醇，置于 60 ℃ 水浴中30 min，靜置于室溫下至細(xì)胞完全無色。取上清液，于485 nm處測吸光度，用吸光度表示細(xì)胞活力。

1.3.2 培養(yǎng)液pH值的測定 取濾液，用PHS-2型精密酸度計測定pH值。

1.3.3 胞外蛋白含量的測定 采用考馬斯亮藍(lán)法[10]測定。取1 mL濾液，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，混勻，放置2 min后，在595 nm下檢測吸光度。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=1.119 9x-0.079 2，r2=0.996 7。

1.3.4 胞外總酚含量的檢測 參照文獻[11-12]測定胞外總酚含量。取5 mL濾液，加入10 mL乙酸乙酯萃取2 h，烘干后加1 mL 95%乙醇重新溶解，與1 mL Folin-Ciocalteu試劑(使用時稀釋10倍)混合，于40 ℃下水浴10 min，再加入 0.4 mL 7.5% Na2CO3溶液和5 mL蒸餾水，充分混勻，于 765 nm 下檢測吸光度。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.087 6x+0.000 6，r2=0.997 1

1.3.5 多酚氧化酶(PPO)樣品制備及活性(鮮質(zhì)量)測定 參照張月玲等的方法[13]，取0.1 g固體細(xì)胞于預(yù)冷的研缽中，加5 mL 0.05mol/L磷酸緩沖液(pH值為6.8)，在冰浴下研磨成勻漿，于4 ℃、4 000 r/min離心5 min，上清液即為粗酶液。在反應(yīng)管中加入3.8 mL 0.05 mol/L pH值為6.8的磷酸緩沖液、1 mL 0.1 mol/L鄰苯二酚、0.2 mL粗酶液，于35 ℃恒溫水浴保溫20 min，迅速冰浴，以磷酸緩沖液作為對照，在 398 nm 處測定吸光度。以1 min內(nèi)398 nm處的吸光度變化0.01定義為1個PPO活性單位(U)。

1.3.6 紫杉醇的提取及測定 紫杉醇的提取及測定參照趙繼鵬等的方法[6]。將固體細(xì)胞于45 ℃烘干至恒質(zhì)量，充分研磨。準(zhǔn)確稱取100 mg干燥后的細(xì)胞，加2 mL甲醇，超聲提取30 min，5 000 r/min離心5 min，取上清液，重復(fù)提取2次。合并上清液，于45 ℃烘干，浸膏加入4 mL雙蒸水后用4 mL二氯甲烷萃取2次，合并二氯甲烷層，于25 ℃烘干，用3 mL甲醇溶解，在228 nm下測定樣品吸光度。用紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=20.83x+1.06，r2=0.997。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel進行數(shù)據(jù)整理，用Origin 8.5.1繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞活力的變化

由圖1可知，在細(xì)胞培養(yǎng)8 d后，加入真菌誘導(dǎo)子后的細(xì)胞活力下降得較快，在后續(xù)培養(yǎng)中，細(xì)胞活力上升平緩，且始終低于初始細(xì)胞活力；而在真菌誘導(dǎo)結(jié)合果糖補料的條件下，細(xì)胞活力下降較為平緩，在培養(yǎng)的11 d后，細(xì)胞活力開始逐步上升，在培養(yǎng)的14 d后，細(xì)胞活力高于初始細(xì)胞活力，增幅為9.34%。

2.2 培養(yǎng)液pH值的變化

由圖2可知，在培養(yǎng)的8 d后，加入真菌誘導(dǎo)子后，培養(yǎng)液pH值降低。其中，只添加真菌誘導(dǎo)子的處理，pH值下降得更快，最大降幅為14.29%；加入真菌誘導(dǎo)子后進行果糖補料，pH值的下降較平緩。

2.3 胞外蛋白質(zhì)含量的變化

在培養(yǎng)的8 d后，只添加真菌誘導(dǎo)子，胞外蛋白質(zhì)含量呈上升趨勢，由誘導(dǎo)初期的11.98 μg/mL上升為培養(yǎng)后期的18.17 μg/mL，增幅為51.67%；在真菌誘導(dǎo)后進行果糖補料，胞外蛋白質(zhì)含量培養(yǎng)在過程中基本保持不變(圖3)。

2.4 胞外總酚含量的變化

由圖4可知，加入誘導(dǎo)子后，胞外總酚含量在培養(yǎng)的9 d后開始上升，在培養(yǎng)后的11 d含量到達(dá)峰值，為 17.92 μg/mL，隨后下降，最后趨于平穩(wěn)。添加真菌誘導(dǎo)和果糖補料后，胞外總酚含量上升，在培養(yǎng)后的10 d達(dá)到峰值，為 26.27 μg/mL，隨后下降，最后趨于平穩(wěn)。

2.5 多酚氧化酶活性的變化

加入誘導(dǎo)子后，PPO活性在培養(yǎng)后的9 d達(dá)到峰值，為62.50 U/g，隨后酶活性下降，在培養(yǎng)的13 d開始，酶活性趨于平穩(wěn)；真菌誘導(dǎo)和果糖補料后，酶活性同樣在9 d達(dá)到峰值，為106.17 U/g，隨后酶活性下降，在培養(yǎng)的10 d后酶活性趨于平穩(wěn)(圖5)。

2.6 紫杉醇含量(干質(zhì)量)

由表1可知，只加入誘導(dǎo)子時，紫杉醇含量首先逐漸下降，在培養(yǎng)10 d時為最低值，隨后含量逐漸升高，在培養(yǎng)的 12 d 達(dá)到峰值26.38 μg/g，與培養(yǎng)8 d的初始值相比，增幅為 24.85%，12 d后，紫杉醇含量逐漸下降。而在加入誘導(dǎo)子的同時加果糖補料，紫杉醇的含量首先逐步升高，在培養(yǎng)12 d時到達(dá)峰值，為20.40 μg/g，與初始值相比紫杉醇含量增幅為170.56%，從培養(yǎng)13 d開始時紫杉醇含量逐漸下降。

3 結(jié)論與討論

細(xì)胞活力與細(xì)胞線粒體活性成正比，線粒體活性越強，細(xì)胞代謝能力越強。在本試驗中，加入真菌誘導(dǎo)子后，細(xì)胞活力下降，可能是由于誘導(dǎo)子對細(xì)胞的損傷使得細(xì)胞活力下降，細(xì)胞活力維持較低水平不變，而添加果糖后，細(xì)胞活力在后期逐步上升，說明懸浮培養(yǎng)后期果糖作為合適碳源，有利于保持細(xì)胞活力，提高代謝能力[14]。

表1 紫杉醇含量(干質(zhì)量)

植物細(xì)胞對pH值具有較強的自我調(diào)控能力，而在本試驗中加入誘導(dǎo)子，培養(yǎng)基pH值持續(xù)下降，這有可能是由于誘導(dǎo)子使胞內(nèi)質(zhì)子大量釋放，從而導(dǎo)致培養(yǎng)基酸化；進行果糖補料后，可以減緩pH值的下降速率，這有可能是由于果糖可以減緩質(zhì)子釋放速率或者使質(zhì)子內(nèi)流而減緩pH值下降[15]。

用真菌誘導(dǎo)后，胞外蛋白含量逐漸升高，原因可能有2個方面：一方面可能因為細(xì)胞代謝增強，蛋白分泌增加，另一方面，可能是細(xì)胞膜通透性改變，其胞內(nèi)蛋白被釋放出來[16]。而細(xì)胞活力與代謝強度成正比，加入真菌誘導(dǎo)子后細(xì)胞活力持續(xù)下降，代謝強度較低，因此可見胞外蛋白含量上升不是由于分泌增加而是由細(xì)胞膜通透性改變引起的。細(xì)胞膜通透性改變可能是外源真菌誘導(dǎo)子處理的紅豆杉細(xì)胞在顯著提高紫杉醇產(chǎn)量的同時，也導(dǎo)致細(xì)胞中氧自由基含量的提高而發(fā)生細(xì)胞氧損傷，從而引起植物的過敏反應(yīng)[17]。而加入真菌誘導(dǎo)子后進行果糖補料，胞外蛋白含量基本保持不變，這有可能是由于果糖可以減弱這種過敏反應(yīng)。

誘導(dǎo)紅豆杉細(xì)胞時，維持適當(dāng)濃度的酚類化合物有利于紫杉醇產(chǎn)量的提高[18]。所以當(dāng)培養(yǎng)體系中加入真菌誘導(dǎo)子后，胞外總酚含量上升，可能是細(xì)胞感受到真菌誘導(dǎo)子侵入而增加酚類化合物的合成以減少傷害；加入真菌誘導(dǎo)子后進行果糖補料能使酚類物質(zhì)迅速積累，同時也能增加紫杉醇的含量。當(dāng)酚類物質(zhì)含量過高時，細(xì)胞通過提高PPO活性來降解酚類物質(zhì)。

研究表明，在南方紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)后期添加果糖能夠解除細(xì)胞合成紫杉醇的碳源限制，從而有效地提高真菌誘導(dǎo)子的誘導(dǎo)效能[18]。Ketchum等研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)周期的中期添加1%果糖，可以提高紫杉醇產(chǎn)量，縮短培養(yǎng)周期[19-20]。在本試驗中，加入誘導(dǎo)子后，紫杉醇含量先下降后上升，上升到峰值后逐步下降，可能是誘導(dǎo)子在誘導(dǎo)初期對細(xì)胞的損傷而使紫杉醇合成受影響，細(xì)胞適應(yīng)后，誘導(dǎo)子誘導(dǎo)細(xì)胞合成紫杉醇而使其含量上升。加入誘導(dǎo)子后進行果糖補料，紫杉醇含量上升沒有受到誘導(dǎo)子的損傷而下降，可進一步說明果糖可以減弱誘導(dǎo)子對細(xì)胞的損傷或者可能是果糖在培養(yǎng)后期更適合用于合成紫杉醇。

因此可見，在用真菌誘導(dǎo)子誘導(dǎo)紅豆杉細(xì)胞時，加入一定量的果糖可以緩解真菌誘導(dǎo)子誘導(dǎo)所引起的紅豆杉細(xì)胞膜脂過氧化等不良反應(yīng)，從而有利于細(xì)胞的生長和紫杉醇產(chǎn)量的提高。