張文雄，徐建軍

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院胸外科，南昌 330006)

嚴(yán)重氣管狹窄、原發(fā)氣管惡性腫瘤或鄰近器官惡性腫瘤的侵犯均需行氣管切除重建。當(dāng)成人氣管切除長度超過1/2（嬰幼兒氣管的1/3）時，端端氣管吻合因極大的張力而導(dǎo)致吻合口撕裂等致命并發(fā)癥[1]。雖然同種異體氣管或異種氣管可以作為替代物，但伴隨移植氣管來源困難、終生免疫抑制治療等缺點(diǎn)，臨床上難以推廣。目前，組織工程已成為解決這一問題的潛在方法。新的氣管構(gòu)架需要能夠被覆纖毛柱狀上皮橫向剛性但縱向柔韌的管狀支撐，同時達(dá)到能夠自我修復(fù)、再血管化以及無免疫排斥等要求。相關(guān)研究目前已有較多報道，但這些組織工程氣管距離臨床實際要求仍有一些差距[2，3]。以下，我們針對構(gòu)建組織工程氣管幾個關(guān)鍵因素進(jìn)行分析。

1 管狀支架構(gòu)建

管狀支架的構(gòu)建對附著細(xì)胞的生物學(xué)活動有很大的影響。一個好的支架應(yīng)該有利于細(xì)胞粘附、遷移、增殖和分化，同時還能夠促進(jìn)組織再生和重塑，不引起局部炎癥反應(yīng)和免疫排斥反應(yīng)。因此，支架制作時應(yīng)采用三維多孔結(jié)構(gòu)，以利于細(xì)胞生長、營養(yǎng)輸送、代謝物清除以及新生血管再生[4]。為防止氣管塌陷，支架結(jié)構(gòu)對機(jī)械強(qiáng)度有一定要求，而氣管支架的強(qiáng)度很大程度上依賴于材料的選擇[5]。合成材料往往具有較好機(jī)械強(qiáng)度，但缺乏天然生物材料所特有的生物活性。現(xiàn)近，合成材料和生物材料的結(jié)合成為主流，這種結(jié)合同時具備了良好的機(jī)械強(qiáng)度和生物活性。

管狀支架的軟骨結(jié)構(gòu)主要由非負(fù)重部位軟骨組織采集的軟骨細(xì)胞來制作，如鼻中隔、外耳等部位[6]。Kojima等運(yùn)用鼻中隔軟骨以及氣管源性軟骨細(xì)胞制作組織工程氣管，發(fā)現(xiàn)他們和自然氣管有相似的機(jī)械特性[7]。Wu等通過培養(yǎng)制作片狀軟骨細(xì)胞團(tuán)聚體，并將它們纏繞在硅膠管上植入兔皮下8周促進(jìn)軟骨組織成熟。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，植入后的軟骨組織在拆除硅膠管后仍保留管狀結(jié)構(gòu)，雖然其機(jī)械強(qiáng)度較自然氣管明顯減低[8]。這提示了利用無支架的軟骨細(xì)胞制作組織工程氣管管狀支架的可能性。作為替代，干細(xì)胞越來越多被用于軟骨組織的制備，其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞因其來源廣、易分離等特點(diǎn)成為運(yùn)用最多的干細(xì)胞來源[9]。Fuchs等比較了軟骨細(xì)胞和軟骨分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)兩者在體內(nèi)移植后的糖胺聚糖、Ⅱ型膠原和彈性蛋白的表達(dá)水平均無明顯差別[10]。Kunisaki等誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化制作工程氣管軟骨支架，其輪廓與自然氣管細(xì)胞外基質(zhì)框架相似[11]。Dikina等在環(huán)狀模型中將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化形成軟骨細(xì)胞環(huán)，進(jìn)而通過疊環(huán)法培養(yǎng)制作無支架軟骨管。這種技術(shù)不僅提高了軸向平面的機(jī)械強(qiáng)度，同時減少了軟骨環(huán)與連接支架的縫合過程[12]。

近年，一些學(xué)者將注意力轉(zhuǎn)移到具有天然細(xì)胞外基質(zhì)的脫細(xì)胞生物組織和器官。這些生物支架材料固有的三維結(jié)構(gòu)和生物特性，有利于細(xì)胞的貼附生長和功能恢復(fù)[13]。將組織中細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)成分去除，僅保留的骨架成分能明顯減少排斥反應(yīng)的風(fēng)險而不影響力學(xué)性能[14]。Conconi等通過生物酶法洗滌細(xì)胞成分獲得細(xì)胞外基質(zhì)骨架，支持軟骨細(xì)胞和氣管上皮細(xì)胞粘附[15]。Seguin等采用深低溫凍存法獲得了相似的去細(xì)胞效果[16]。Butler等運(yùn)用酶法去細(xì)胞的同時，輔助運(yùn)用真空環(huán)境進(jìn)行輔助，能達(dá)到更好的去細(xì)胞效果并縮短制備[17]。Xu等運(yùn)用微孔化處理去細(xì)胞同種異體去細(xì)胞氣管支架并結(jié)合自體軟骨細(xì)胞植入，所得到的移植氣管在體內(nèi)實驗中能達(dá)到較原生氣管更好的機(jī)械強(qiáng)度[18]。Jungebluth等在動物實驗中證實，豬氣管在17次反復(fù)酶法去細(xì)胞后基本消除MHCⅠ類和Ⅱ類抗原[19]。這項研究從理論上證實將動物氣管用于人氣管移植的可行性，這將解決供體氣管來源不足的問題，但該技術(shù)用于臨床仍需大量驗證。主動脈因其抗原少、滋養(yǎng)血管少以及不分泌粘液等特點(diǎn)，在一些報道中被用來做氣管替代物。Martinod等在羊體內(nèi)實驗中證實了血管作為氣管移植物的可行性[20]。Wurtz等運(yùn)用同種異體主動脈對6名氣管涎腺型癌患者進(jìn)行氣管移植，所有移植物均能得到很好的再血管化和部分上皮被覆，術(shù)后患者均能很好耐受[21]。

隨著3D打印技術(shù)的成熟，其在組織工程中的運(yùn)用受到了重視。較傳統(tǒng)方法，運(yùn)用3D打印制造氣管支架更符合個體化的氣管形態(tài)要求，并可以明顯減少制備時間。Bhora等運(yùn)用聚己內(nèi)酯制作3D移植氣管并在豬體內(nèi)實驗進(jìn)行驗證，術(shù)后2周病理檢查提示吻合口明顯的肉芽組織增生伴部分上皮化[22]。Rehmani等的研究取得類似的結(jié)果，5/7的實驗動物（豬）生存時間超過3個月同時不影響生長[23]。Gao等同樣運(yùn)用聚己內(nèi)酯制作網(wǎng)狀3D移植氣管，并在其上植入軟骨細(xì)胞，移植后兔最長存活時間達(dá)10周，最常見的死亡原因為肉芽組織增生所致的嚴(yán)重氣管狹窄[24]。

2 氣管再上皮化

移植氣管上皮層缺失可導(dǎo)致肉芽組織增生以及痰液潴留，嚴(yán)重的可致致命的氣道阻塞[12，25]。雖然受體氣管上的纖毛上皮細(xì)胞能移行至供體氣管上，但這個過程需要數(shù)月時間。因此有研究表明，上皮細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的種植在氣管移植物存活中均不可缺少，缺少其中1種或2種均缺少時常因氣道阻塞和感染導(dǎo)致移植失敗[26]。以往，組織工程氣管上皮層制備主要提取氣管、鼻中隔或鼻甲的呼吸上皮，其種植后可進(jìn)一步分化產(chǎn)生纖毛上皮細(xì)胞、杯狀細(xì)胞以及基底細(xì)胞[27]。然而，呼吸道上皮的獲取從技術(shù)上較困難且數(shù)量少，難以滿足組織工程氣管制備的需求。因此，干細(xì)胞在上皮化中的運(yùn)用日漸受到重視，Batioglu等在兔體內(nèi)實驗中發(fā)現(xiàn)，植入脂肪組織來源的組織間充質(zhì)干細(xì)胞能明顯降低脫細(xì)胞氣管移植術(shù)后氣道狹窄、感染等并發(fā)癥的發(fā)生率及嚴(yán)重程度[28]。Kim等發(fā)現(xiàn)，皮膚上皮干細(xì)胞植入能很好的分化為氣管上皮細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，這提示將皮膚上皮干細(xì)胞用于氣管上皮再生的替代細(xì)胞來源的可能性[29]。

上皮細(xì)胞與間充質(zhì)間的相互作用在多種器官的形成過程中起到重要作用。Goto等發(fā)現(xiàn)，與皮膚和氣管中成纖維細(xì)胞共同培養(yǎng)的氣管上皮細(xì)胞能促進(jìn)假復(fù)層柱狀上皮以及纖毛的形成，其中杯狀細(xì)胞和基底細(xì)胞的比率和自然氣管相似，這種現(xiàn)象在單獨(dú)培養(yǎng)氣管上皮細(xì)胞時是不存在的[30]。Kobayashi等發(fā)現(xiàn)牙齦成纖維細(xì)胞能促進(jìn)氣管上皮細(xì)胞的分化和上皮重建，形成和正常氣管相似的假復(fù)層纖毛柱狀上皮層[31]。這表明，氣管上皮細(xì)胞層的形成受成纖維細(xì)胞分泌的可溶性因子介導(dǎo)。因此，雙層細(xì)胞種植（氣管上皮細(xì)胞+成纖維細(xì)胞）的概念被提出，在體內(nèi)模型（羊）中發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)能較好的支持上皮細(xì)胞層形成且不產(chǎn)生明顯的纖維化[32]。除了成纖維細(xì)胞外，血管內(nèi)皮細(xì)胞在氣管上皮的形成和修復(fù)中也發(fā)揮了重要的作用。Zani等發(fā)現(xiàn)，上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞均能促進(jìn)去細(xì)胞氣管骨架的再上皮化，且兩者同時存在時效果最佳。其中上皮細(xì)胞限制組織損傷和間質(zhì)增生，而內(nèi)皮細(xì)胞維持上皮層和血管的穩(wěn)定[33]。由此，在未來組織工程氣管的制備中，除了需要種植軟骨細(xì)胞和氣管上皮細(xì)胞外，成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞也應(yīng)該得到重視。

3 再血管化

血管化對于移植物的存活非常重要，特別是大而厚的移植物。對于短的移植氣管，血管內(nèi)皮細(xì)胞能從固有氣管內(nèi)向生長并及時形成新生血管以維持上皮的存活。然而，長段氣管移植時，新生血管較難達(dá)到移植氣管的中點(diǎn)，因而易致缺血改變。移植氣管缺血能誘發(fā)較多致命的并發(fā)癥，如肉芽組織增生、氣管狹窄等[12]。Luo等在兔模型中將移植氣管植入胸骨舌骨肌內(nèi)進(jìn)行血管化預(yù)處理。結(jié)果顯示，進(jìn)過預(yù)處理的移植氣管較對照組具有更好的纖毛上皮化生以及軟骨結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[34]。Elizabeth等發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過再血管化的移植氣管較單純?nèi)ゼ?xì)胞氣管能明顯降低術(shù)后氣管狹窄的發(fā)生[35]。這表明，移植物的早期血管化不僅能維持細(xì)胞活性，對移植物結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性也有很大的影響。

以下介紹幾種加速新生血管形成的方法：1.在工程氣管制備時，植入血管內(nèi)皮細(xì)胞，不僅能維持上皮層和血管的穩(wěn)定，也能加速新生血管的再生；2.血管生成因子、重組人促紅細(xì)胞生成素和血管內(nèi)皮生長因子等均在研究中證實能加快移植氣管新生血管的形成[36，37]；3.在移植前將組織工程氣管進(jìn)行血管化預(yù)處理，如將工程氣管植入大網(wǎng)膜等富血管的受體組織中進(jìn)行先期培養(yǎng)[38]；4.在器官移植時同期運(yùn)用受體富血管組織進(jìn)行包繞，最常用的組織是帶血管的大網(wǎng)膜和肌瓣。這些富含血管的組織能夠迅速的使移植氣管再血管化以減少組織缺血范圍和程度[39]。

4 氣管移植的臨床運(yùn)用

氣管移植臨床已有較多報道，2008年，Macchiarini等報道了第一例組織工程氣管移植案例[40]。在去細(xì)胞同種異體氣管支架上植入上皮細(xì)胞和軟骨細(xì)胞后，置入生物反應(yīng)器中培養(yǎng)96h。在移植后5年的隨訪中，患者無明顯排斥反應(yīng)，生活質(zhì)量顯著改善，雖然在吻合口部位存在瘢痕性狹窄，但并不妨礙患者的正常生活[41]。氣管功能測試表明，患者已恢復(fù)正常的肺功能、咳嗽敏感性和排斥力。

Delaere等報道了另一個同種異體氣管移植的成功病例。術(shù)前將移植氣管置入患者前臂皮下進(jìn)行預(yù)血管化，34d后在氣管后壁植入患者口腔黏膜細(xì)胞并再上皮化4個月。雖然移植氣管并未進(jìn)行去細(xì)胞處理，但術(shù)前移植氣管的上皮細(xì)胞已經(jīng)消失，患者術(shù)后呼吸功能明顯改善[42]。相較于前一病例，作者推測，將移植氣管進(jìn)行異位移植后，供體的氣管上皮細(xì)胞會被受體潛移默化的排斥掉，而軟骨骨架因其無血管性而逃脫了免疫監(jiān)視。

Elliot等報道了第一例兒童（10歲）組織工程氣管移植病例[43]。移植氣管采用脫細(xì)胞的同種異體氣管骨架被覆未分化的自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以及呼吸上皮細(xì)胞補(bǔ)片。氣管移植后配合使用重組人促紅細(xì)胞生成素、粒細(xì)胞集落刺激因子和轉(zhuǎn)化生長因子促進(jìn)血管再生、干細(xì)胞軟骨分化等。術(shù)后1周能發(fā)現(xiàn)血管生成證據(jù)，15個月后氣管纖毛上皮化完成，18個月后移植氣管恢復(fù)正常的機(jī)械強(qiáng)度。在4年的隨訪中，患者恢復(fù)正常的生活。

Jungebluth等報道首例運(yùn)用納米復(fù)合材料（多面體倍半硅氧烷納米銀微粒+聚氨基甲酸乙酯，POSS-PCU）構(gòu)建移植氣管支架被覆未分化的自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用于臨床氣管移植病例[44]。POSS-PCU具有良好的生物相容性、非生物降解性、溫和的免疫原性、高機(jī)械強(qiáng)度、易延展性和無毒性，使其適合于組織工程中的應(yīng)用。相比于同種異體氣管支架，納米復(fù)合材料更加容易制備以滿足患者的需求?；颊咝g(shù)后1周出現(xiàn)細(xì)菌和真菌感染，2個月后氣管內(nèi)鏡活檢提示表皮細(xì)胞再生和新生血管的形成，5個月后患者恢復(fù)正常呼吸功能。

Fabre等報道了12例運(yùn)用自體組織構(gòu)建移植氣管的病例，他們采用帶血管蒂皮瓣（前臂內(nèi)側(cè)獲取）內(nèi)襯片狀肋軟骨環(huán)，皮瓣滋養(yǎng)血管與胸廓內(nèi)動靜脈吻合。術(shù)后所有患者均出現(xiàn)不同程度肺部感染癥狀，經(jīng)保守治療后均康復(fù)出院。腫瘤患者術(shù)后5年生存期達(dá)64.8%，主要死亡原因為腫瘤復(fù)發(fā)。這種移植氣管的制備免除了術(shù)后抗排斥藥物的使用并且明顯縮短了準(zhǔn)備時間，在世界范圍內(nèi)得到了一定的認(rèn)可和推廣[45]。

然而，并不是所有接受移植的患者均恢復(fù)了正常的生活，一些患者死于潛在的并發(fā)癥。Martinod等報道1例移植失敗案例，15歲女性患者因嚴(yán)重氣管狹窄接受干細(xì)胞種植組織工程氣管移植，患者3周后死于急性胸內(nèi)出血所致的氣管壓迫窒息[46]。Berg等對一位76歲氣管狹窄患者進(jìn)行氣管移植，移植氣管采用去細(xì)胞同種異體氣管+自體干細(xì)胞植入，患者23d后死于心跳驟停[47]。

5 面臨的問題

組織工程氣管移植雖有一些成功報道，但作為常規(guī)技術(shù)在臨床上廣泛使用仍存在一些問題亟待解決。為了更好的了解工程支架和移植細(xì)胞在體內(nèi)的過程，需要進(jìn)行更多的前期動物實驗，以確保臨床應(yīng)用前的安全性、有效性和可重復(fù)性。

組織工程氣管面臨的最大障礙是血管化太慢不能滿足移植氣管中活細(xì)胞的需求。血管從上下吻合口處穿過術(shù)后的移植氣管，需要數(shù)月的時間才能達(dá)到長氣管的中點(diǎn)，從而導(dǎo)致氣管中部的缺血性壞死。組織壞死導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和氣管狹窄。雖然上面已經(jīng)提出并實驗了幾種促進(jìn)血管形成的方法，但這些技術(shù)并沒有達(dá)到完全令人滿意的結(jié)果。

目前，脫細(xì)胞的同種異種氣管移植似乎是一種理想的支架材料，其基質(zhì)組成和微觀結(jié)構(gòu)和供體氣管組織相同。此外，完整的脫細(xì)胞能明顯降低免疫排斥的風(fēng)險，并由受體細(xì)胞促進(jìn)支架的內(nèi)皮化。然而，脫細(xì)胞同種異體氣管移植的供體數(shù)量嚴(yán)重不足限制了其臨床應(yīng)用。此外，還需要更加有效、高效的脫細(xì)胞技術(shù)以減少處理時間，同時保留所有有利于上皮再生的生物學(xué)特性。

另一個關(guān)于組織工程氣管的問題是移植氣管的增長（直徑和長度），這對于兒童患者是至關(guān)重要的。因為兒童患者的身高隨著年齡的增長而增加，移植氣管缺乏成長性可能妨礙兒童患者的生長，甚至威脅生命。因此，在兒童患者移植氣管的設(shè)計中，必須要確保氣管的成長性，雖然Hamilton等的研究表明移植氣管的兩端直徑能夠增加，但這種增加可能是由機(jī)械牽拉引起的[48]。

雖然有許多較好的組織工程氣管已經(jīng)過設(shè)計使用，但往往都是針對特定受體定制的。這大大影響氣管制造的一致性，而且造成移植物的質(zhì)量差異很大。如何能夠規(guī)范的、批量的制備合格的移植氣管仍是一個巨大的挑戰(zhàn)。此外，移植物的儲存、運(yùn)輸還有足夠的保質(zhì)期也是亟待解決的問題。

6 展望

氣管置換通常不是救命的手術(shù)，但可以極大的改善患者癥狀和預(yù)后。綜前所述，組織工程氣管因其成本低、可批量制造以及制備時間短等特點(diǎn)是移植氣管的重要選擇。雖然，有較多氣管移植成功的病例報道。但制作一個全功能的組織工程氣管仍有很多困難需要解決，尤其在移植物再血管化以及組織功能化方面。其中，血管生成研究的最新進(jìn)展可能是實現(xiàn)這一目標(biāo)的關(guān)鍵。相信在將來，具有全功能化的組織工程氣管廣泛用于臨床不再是夢想。