黃 姍 寇山林 劉加順 彭麗敏

（濰坊護(hù)理職業(yè)學(xué)院，山東青州 262500）

農(nóng)作物病蟲害是制約我國生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要因素?；瘜W(xué)農(nóng)藥的興起對防治病蟲害起到了非常重要的作用，但是化學(xué)農(nóng)藥具有易殘留和易污染環(huán)境等特點(diǎn)，因此，利用生物治劑防治農(nóng)業(yè)害蟲越來越受重視[1]。昆蟲病原真菌是重要的生物防治來源，國內(nèi)外利用蟲生真菌防治蝗蟲、蠐螬等農(nóng)業(yè)害蟲已取得階段性進(jìn)展，但對能引起自然流行病的病原菌株研究相對較少[2-4]。本研究收集田間感染流行病的鱗翅目僵蟲，對其病原菌株進(jìn)行分離純化，觀察菌株的生長狀況和培養(yǎng)特征，同時對菌株ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增和分析，最后確定該流行病菌株的分類地位。

1 材料

1.1 僵蟲 僵蟲標(biāo)本采集自山東省臨沂市農(nóng)家田地，經(jīng)鑒定該批受真菌侵染死亡的昆蟲多數(shù)為鱗翅目幼蟲。

1.2 供試培養(yǎng)基 薩氏麥芽糖瓊脂培養(yǎng)基（SMAY）和1/4SDAY培養(yǎng)基均參照文獻(xiàn)[1]的方法配制。

1.3 主要試劑 PCR擴(kuò)增試劑購自天根生化科技（北京）有限公司，真菌核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)基因ITS引物通過Primer5.0軟件設(shè)計(jì)，由生物工程(上海)有限公司合成。

2 試驗(yàn)方法

2.1 菌株分離純化 2016年6月，從臨沂市沂水縣的農(nóng)家田地發(fā)現(xiàn)大量昆蟲僵蟲，收集部分僵蟲至實(shí)驗(yàn)室，用無菌水沖洗僵蟲表面的分生孢子，制成分生孢子懸浮液，制作臨時裝片，在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)所有僵蟲體表的分生孢子形態(tài)大小一致，從僵蟲中隨機(jī)抽取1例進(jìn)行病原真菌的分離培養(yǎng)。具體方法是用接種針蘸取蟲體表面的分生孢子劃線接種到1/4SDAY培養(yǎng)平板上，將平板置于25 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待孢子萌發(fā)長出菌落后，將形態(tài)不同的菌落挑到新的平板上進(jìn)一步接種純化，直至獲得菌株純培養(yǎng)。

2.2 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定 將分離到的病原菌接種到SMAY產(chǎn)孢培養(yǎng)基上，觀察菌落特征，插片培養(yǎng)菌株，待其開始產(chǎn)孢時，將玻片取出制作臨時裝片于顯微鏡下觀察，記錄菌株菌絲、分生孢子梗及分生孢子的顯微形態(tài)，根據(jù)菌株菌落特征、孢子梗形態(tài)及孢子發(fā)生方式進(jìn)行形態(tài)鑒定。

2.3 菌株的分子生物學(xué)鑒定 在SMAY平板上培養(yǎng)菌株，待大量產(chǎn)孢后，刮取分生孢子至研缽中，加液氮研磨以提取基因組DNA，提取方法按DNA提取試劑盒說明進(jìn)行，Primer5.0設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增ITS序列，并將擴(kuò)增產(chǎn)物送至華大基因進(jìn)行雙向測序，測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對，確定與其親緣關(guān)系近的菌株。

3 結(jié)果與分析

3.1 菌株的菌落形態(tài)特征 將菌株的分生孢子接到新的SMAY培養(yǎng)基上，3 d后即見白色絨毛狀菌落，隨著培養(yǎng)時間的增長，菌落不斷擴(kuò)大并逐漸變干燥，菌落背面呈紅褐色，易皺裂。培養(yǎng)10 d左右，在菌落中部開始呈現(xiàn)綠色的分生孢子，并逐漸朝內(nèi)外蔓延，最終整個菌落被分生孢子覆蓋，呈橄欖綠色。

3.2 菌株顯微形態(tài)特征 插片培養(yǎng)法培養(yǎng)菌株，制作臨時裝片，觀察菌株菌絲、孢子梗及孢子形態(tài)，在光學(xué)顯微鏡下，Mr01的分生孢子近似橢圓形狀，呈淡綠色，有些孢子連接在一起。此顯微形態(tài)與報(bào)道的萊氏綠僵菌分生孢子相同。

3.3 菌株分子生物學(xué)鑒定結(jié)果 將Mr01菌株的ITS序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對，發(fā)現(xiàn)與其相似性較高的菌株均為萊氏綠僵菌，因此確定該菌株為萊氏綠僵菌。

4 討論

昆蟲病原真菌是進(jìn)行害蟲生物防治的重要資源，而能引起昆蟲流行病的菌株尤為受重視。本研究從批量染病的僵蟲尸體上分離純化到一株病原菌，從其形態(tài)上初步確定其為萊氏綠僵菌。為更準(zhǔn)確地確定其分類地位，本研究對ITS序列進(jìn)行了擴(kuò)增，并在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)與菌株親緣關(guān)系最近的是萊氏綠僵菌，因此，確定此種引起田間昆蟲流行病的菌株為萊氏綠僵菌。下一步還需對該菌的生長特性、產(chǎn)孢機(jī)理及流行病學(xué)等方面進(jìn)行研究，以研制出高效生物農(nóng)藥應(yīng)用劑型。

[1]于海勇.斜紋夜蛾幼蟲表皮對萊氏野村菌侵染的防御功能研究[D].重慶：重慶大學(xué)，2011.

[2]孔瓊，袁盛勇，吳志剛，等.營養(yǎng)物質(zhì)對萊氏野村菌MZ060806生長的影響[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010（5）：1544-1547.

[3]馬維思，徐常青，張金良，等.金銀花尺蠖及棉鈴蟲的一種病原真菌鑒定[J].中藥農(nóng)業(yè)，2015（9）：934-937.

[4]呂思行，鄭常格，江敏華，等.一株昆蟲病原性真菌萊氏野村菌的分離與鑒定[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015（15）：53-56.