韓慕天，程洪波，王家雄，沈麗燕，王改改，宋　丹，楊慎敏，王馥新，許詠樂，王　瑋，李　紅，史軼超

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院生殖遺傳中心，江蘇蘇州　215000)

生殖道感染對女性生育的影響一直受到大家的重視，但個別生殖道微生物對生育的影響還存在著爭議[1]，如解脲支原體(ureaplasma urealyticum，UU)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，檢測方法也越來越精準(zhǔn)。新技術(shù)的出現(xiàn)讓我們能更快速和準(zhǔn)確地檢出各種生殖道病原體。流行病學(xué)研究表明，解脲支原體(UU)、沙眼衣原體(CT)、生殖支原體(MG)是非淋菌性尿道炎(NGU)最常見的病原體。其中UU的感染率為11%～26%，CT為11%～50%，MG為6%～50%[2]。UU是泌尿生殖道的常見微生物之一，因其可以分解尿素而得名[3]。目前，我國人群中UU的感染率日趨上升，由于反復(fù)感染以及抗生素濫用等原因，使之成為發(fā)病率較高的性傳播疾病之一。UU感染后，患者多無明顯癥狀，也易造成醫(yī)生漏診[4]。本文研究對象為不孕女性群體，旨在闡明該群體的生殖道微生物分布特征。隨著分子生物學(xué)診斷技術(shù)的發(fā)展，生殖道病原體的檢測經(jīng)歷由培養(yǎng)法、免疫法到核酸檢測法多個階段[5～7]。病原體分離培養(yǎng)法被認(rèn)為是“金標(biāo)準(zhǔn)”方法[8]。然而分離培養(yǎng)操作復(fù)雜，所需時間較長和敏感度易受標(biāo)本采集方式等影響，對臨床常規(guī)檢測和流行病學(xué)篩查帶來了一定的困難。加之培養(yǎng)法取樣采用拭子樣本，該取樣方式給病患帶來一定的痛苦，尤其是男性患者，一些檢測方法結(jié)果判定具有一定的主觀性，容易引起假陽性和假陰性，給臨床診斷帶來一些困難。免疫學(xué)檢測技術(shù)也得到了廣泛的應(yīng)用[9]，但由于質(zhì)控困難，并且只能定性不能定量，加之有交叉抗原的存在[10]，故其應(yīng)用得到了很大的限制。DNA檢測技術(shù)有效地彌補(bǔ)上述不足，敏感度較高，其缺點(diǎn)在于不能進(jìn)行藥敏試驗(yàn)以及無法區(qū)分死亡和活動的病原體，故對于在治愈初期的病患，檢測結(jié)果也可能是陽性[2]。故臨床上急需建立一種靈敏、可靠的檢測方法，以求能夠準(zhǔn)確檢測出病原體。本研究運(yùn)用核酸恒溫擴(kuò)增技術(shù)(Simultaneous amplification and testing，SAT)檢測女性陰道分泌物中的UU，CT，MG和NG，并將其與培養(yǎng)法及乳膠法進(jìn)行比較分析，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1　材料與方法

1.1研究對象2016年6～9月于本院生殖中心門診就診的不孕女性患者467例，年齡20～48歲，平均年齡31.52±6.83歲。其中352例行輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology,ART)治療。對照組選取105例已生育婦女體檢拭子標(biāo)本進(jìn)行檢測。采集標(biāo)本之前1月內(nèi)所有受試對象均未采取陰道灌洗、抗生素治療等措施，并處于非月經(jīng)期。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會允許，患者知情同意。

1.2試劑與儀器UU，CT，NG和MG核酸檢測試劑盒(YZB/國3011- 2014)；MagX全自動核酸提取儀(上海仁度生物科技有限公司)；定量PCR儀(西安天隆科技有限公司)；UU培養(yǎng)鑒定藥敏試劑盒(珠海麗珠生物科技有限公司)；CT，NG乳膠免疫層析法試劑盒(南京黎明生物制品有限公司)。

1.3標(biāo)本采集用無菌棉拭子伸入女性宮頸口1～2 cm，旋轉(zhuǎn)幾周并停留數(shù)秒后取出，行ART的患者同時取兩份拭子標(biāo)本，分別用不同的方法進(jìn)行檢測。

1.4樣本檢測

1.4.1培養(yǎng)法(用于UU檢測)：將采集的標(biāo)本插入培養(yǎng)液中，擠壓旋轉(zhuǎn)三次，將培養(yǎng)液置于37℃溫箱中培養(yǎng)48 h后觀察結(jié)果，若培養(yǎng)液變?yōu)榧t色并清亮透明，即為陽性。不變色即為陰性。若培養(yǎng)液變紅并伴有渾濁，則將培養(yǎng)液接種于10 mg/dl血平皿中，按照臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程對微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)和鑒定。

1.4.2乳膠法(用于CT，NG檢測)：將采集的標(biāo)本插入生理鹽水中，擠壓旋轉(zhuǎn)三次，即為待測樣本。測試時，將待測樣本滴入檢測卡加樣孔內(nèi)，陽性標(biāo)本在測試區(qū)(T)內(nèi)會出現(xiàn)一條紅色條帶。陰性樣本由于不含檢測目的抗原，在測試區(qū)(T)內(nèi)不能形成夾心復(fù)合物，故沒有紅色條帶出現(xiàn)。

1.4.3SAT法：拭子標(biāo)本取出后放入1 ml生理鹽水充分浸泡后貼壁擠干，取0.5 ml與等體積的樣本保存液混合，即為待測樣本。使用MagX全自動核酸提取儀進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。首先，病原體被裂解釋放出核酸，與核酸提取液中的相應(yīng)磁性顆粒特異度結(jié)合，利用磁珠吸附純化UU，CT，NG和MG的靶標(biāo)RNA。加入42℃預(yù)熱的SAT酶液，于PCR儀上擴(kuò)增40個循環(huán)，熒光標(biāo)記的優(yōu)化探針與RNA拷貝特異性結(jié)合，產(chǎn)生的熒光由儀器進(jìn)行檢測。結(jié)果判斷：dt表示樣本曲線與閾值線交點(diǎn)的循環(huán)數(shù)，dt≤35的標(biāo)本判為陽性。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 17.0軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，兩方法對比使用配對四格表χ2檢驗(yàn)，當(dāng)T<1時使用Fisher確切概率法分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1不孕女性生殖道UU，CT，NG和MG分布狀況467例不孕女性生殖道拭子UU，CT，NG和MG經(jīng)SAT法檢測結(jié)果如下。其中UU陽性例數(shù)最多，陽性率62.53%(292/467)。CT陽性9例，陽性率1.93%(9/467)。NG陽性1例，陽性率0.21%(1/467)。MG陽性8例，陽性率1.71%(8/467)。與正常生育女性組23.81%(25/105)對比，不孕女性組UU感染率明顯增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=52.01，P<0.01)。

2.2UU培養(yǎng)法和SAT檢測結(jié)果陽性率比較選取其中352例受檢女性進(jìn)行UU拭子培養(yǎng)和SAT檢測結(jié)果比較。SAT法檢測UU陽性率為63.9%(225/352)，敏感度95.9%，特異度66.7%。培養(yǎng)法檢測陽性率為48.9%(172/352)，敏感度73.3%，特異度94.5%，兩樣本經(jīng)配對四格表χ2檢驗(yàn)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=41.93，P<0.01)。其中60例樣本拭子培養(yǎng)陰性而SAT法檢測陽性，有7例樣本培養(yǎng)法檢測陽性SAT法檢測陰性。

2.3CT乳膠法和SAT檢測結(jié)果陽性率比較352例受檢女性CT乳膠法檢測結(jié)果。SAT法檢測CT陽性例數(shù)為6例，陽性率1.7%(6/352)，敏感度100%，特異度98.6%。乳膠法檢測陽性1例，陽性率0.3%(1/352)，敏感度16.7%，特異度100%，兩樣本經(jīng)Fisher確切概率法統(tǒng)計分析，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。NG兩種檢測法均無陽性檢出，MG僅用SAT法檢測未作比較。

3　討論

UU是泌尿生殖道常見的一種共生微生物，其感染與多種疾病相關(guān)，包括非淋菌性尿道炎、宮頸炎、慢性前列腺炎、附睪炎以及不孕不育等[11，12]。CT是一類胞內(nèi)寄生的微生物，能夠感染男、女性泌尿生殖道[13]。在女性中能引起盆腔炎、宮頸炎、宮內(nèi)感染等多種疾病[14]。然而在CT感染者中，約70%～80%的女性常常無明顯的臨床癥狀[15]，故可靠的實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果對疾病的診斷顯得尤為重要。NG感染可導(dǎo)致一系列疾病，以宮頸炎和尿道炎最常見，并可進(jìn)一步上行入侵引起睪丸炎、盆腔炎、輸卵管炎，甚至擴(kuò)散至全身引起廣泛的炎癥反應(yīng)。淋病還可導(dǎo)致女性不孕、胎膜早破、異位妊娠和男性不育等病癥，使臨床檢測和治療面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[16]。MG不僅可以引起尿道炎和宮頸炎，并且近60%子宮內(nèi)膜炎患者的宮頸黏液中能夠檢測出MG[17]。MG感染與子宮內(nèi)膜炎和復(fù)發(fā)性盆腔炎有相關(guān)性[18]。值得一提的是，MG的檢測僅限于核酸擴(kuò)增試驗(yàn)。培養(yǎng)法所需時間過長，需要數(shù)月，并且敏感度不佳[19]。至今為止，血清學(xué)測定法和抗原檢測等方法均不能應(yīng)用于MG的檢測。核酸擴(kuò)增試驗(yàn)是MG唯一可行的診斷方法[20]。本研究結(jié)果顯示，不孕癥女性中UU感染率為62.53%，CT感染率為1.93%，NG感染率為0.21%，MG感染率為1.71%。UU是不孕女性生殖道檢出率最高的微生物。顯示UU和女性不孕癥存在著密切的關(guān)系。值得注意的是，本研究中CT或MG陽性的患者中僅一例為UU陰性，其余均為并發(fā)感染，提示我們不同病原體感染之間可能存在著一定的關(guān)聯(lián)性。

隨著分子診斷技術(shù)的發(fā)展，病原體檢測方法需要滿足準(zhǔn)確、高效和靈敏等要求。RNA檢測技術(shù)因其特異、靈敏的優(yōu)勢廣泛的用于生殖道病原體的檢測。RNA檢測技術(shù)包括SAT和轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增(transcription- mediated amplification，TMA)，這兩種檢測方法的擴(kuò)增原理完全相同。由于病原體細(xì)胞中的RNA存在多個拷貝，故RNA檢測技術(shù)相較于以DNA有更高的準(zhǔn)確度，更重要的是只有活的病原體中存在完整RNA片段，故能排除治愈后已死亡病原體對檢測結(jié)果的影響[2]。RNA具有易降解、不穩(wěn)定的特性，使得該法交叉污染可能性更小，可以有效減少假陽性的產(chǎn)生，大大提高了檢測結(jié)果的可靠性，有助于臨床診斷的準(zhǔn)確度和對療效的監(jiān)測[21，22]。此外，RNA檢測結(jié)果還可以用于臨床療效監(jiān)測，符合精準(zhǔn)醫(yī)療的要求，是目前生殖道病原體檢測的首選方法。本研究中泌尿生殖道感染患者的拭子樣本，SAT法結(jié)果和培養(yǎng)法檢測UU相比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，SAT法的陽性率更高，敏感度更強(qiáng)。這與鄭渠等[23]報道的培養(yǎng)法與SAT法檢測效能相當(dāng)不同。SAT法與乳膠法檢測CT結(jié)果相比，前者陽性率以及敏感度亦明顯更高?；赟AT法可以以尿液檢測的優(yōu)勢，兼具檢測時間短、假陽性率低等優(yōu)勢，尤其當(dāng)受檢者正處于感染初期，病原體數(shù)量較少，DNA含量少，而RNA較多，SAT法對該類病人的檢測具有獨(dú)特的優(yōu)勢[24]，故該技術(shù)更適合作為體檢檢測方法進(jìn)行人群篩選。然而由于SAT法敏感度強(qiáng)，容易被環(huán)境中的病原體或異物污染，故對實(shí)驗(yàn)室條件的要求更多，成本更高。此外，培養(yǎng)法可直接進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，有助于指導(dǎo)臨床用藥，該法更適合作為篩選后的確診方法。綜上所述，SAT法和常規(guī)法聯(lián)合檢測UU，CT，NG和MG將為臨床提供既準(zhǔn)確又快捷的診斷依據(jù)。

綜上所述，與其他方法比較，SAT法的優(yōu)勢更明顯，如無創(chuàng)、操作簡便、重復(fù)性好、敏感度高，并且一份標(biāo)本可以進(jìn)行多個項(xiàng)目的檢測，避免多次取樣之間的差異。更重要的是運(yùn)用SAT法對病原體進(jìn)行定量檢測還可以應(yīng)用到分子生物學(xué)研究、流行病學(xué)的統(tǒng)計與調(diào)查、疾病的早期診斷、分型與預(yù)后等多個方面為臨床提供強(qiáng)有力的理論依據(jù)。

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