陳冰

2012年，體細(xì)胞重編程技術(shù)獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。就在那一年，蒲慕明和同事們?cè)谡憬瓰蹑?zhèn)舉行的非人靈長(zhǎng)類(lèi)研究小型專(zhuān)題研討會(huì)上提出：再難也要把體細(xì)胞克隆猴做出來(lái)！

2017年11月27日，世界上首只體細(xì)胞克隆猴“中中”在中國(guó)誕生，緊接著，10天之后，第二只克隆猴“華華”又順利誕生。1月25日，由位于上海的中國(guó)科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所蒲慕明、孫強(qiáng)領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)在國(guó)際權(quán)威學(xué)術(shù)期刊《細(xì)胞》上發(fā)表論文，宣布了這一令世界震驚的成果。

從1996年第一只克隆羊“多莉”誕生以來(lái)，21年間，各國(guó)科學(xué)家利用體細(xì)胞先后克隆了牛、鼠、貓、狗等動(dòng)物，但一直沒(méi)有跨越與人類(lèi)最相近的非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的“屏障”。

“全世界的神經(jīng)科學(xué)家和藥企都在期盼它們的出現(xiàn)。”中國(guó)科學(xué)院院士、神經(jīng)所所長(zhǎng)蒲慕明說(shuō)，腦科學(xué)發(fā)展到今天，小鼠的大腦與人腦的區(qū)別太大，已無(wú)法勝任很多實(shí)驗(yàn)任務(wù)，無(wú)論是新藥研發(fā)還是科學(xué)研究，都需要發(fā)展出更接近人類(lèi)的非人靈長(zhǎng)類(lèi)模式動(dòng)物。

體細(xì)胞克隆猴的成功，標(biāo)志著最接近人類(lèi)的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物——猴子將成為了人類(lèi)疾病的動(dòng)物模型，它將為腦疾病、免疫缺陷、腫瘤、代謝等疾病的機(jī)理研究、干預(yù)、診治帶來(lái)前所未有的光明前景?！斑@是世界生命科學(xué)領(lǐng)域近年來(lái)的重大突破?！逼涯矫髟菏空f(shuō)。

克隆猴為什么難？它的誕生有什么價(jià)值？它為什么又會(huì)誕生在中國(guó)呢？

中國(guó)式攻關(guān)

截至目前，同為雌性的克隆猴“中中”和“華華”已經(jīng)在恒溫箱里茁壯成長(zhǎng)了兩個(gè)月，在科研人員24小時(shí)的精心呵護(hù)下，它們的各項(xiàng)身體指標(biāo)均很正常，發(fā)育狀態(tài)良好。除了體形大小略有差異，姐妹倆看不出什么區(qū)別。喝奶粉、玩娃娃、互相打鬧，它們的萌表情吸引了全世界的目光。

其實(shí)，“中中”和“華華”并不是世界上誕生的第一只克隆猴。早在2000年，美國(guó)俄勒岡靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物研究中心就通過(guò)胚胎分裂法克隆了獼猴Tetra。這種克隆方法不同于科學(xué)家們常用的體細(xì)胞核移植技術(shù)，而是把多個(gè)猴胚胎（107個(gè)）進(jìn)行分裂，然后對(duì)胚胎進(jìn)行移植，結(jié)果有4個(gè)能夠發(fā)育，最終只有Tetra在胚胎分裂157天之后幸運(yùn)地降生。不過(guò)這種克隆方法并沒(méi)有得到學(xué)術(shù)界較大關(guān)注，因?yàn)樗c一般意義上的體細(xì)胞克隆技術(shù)有較大差別，技術(shù)難度也不在一個(gè)層次上。

體細(xì)胞是一個(gè)相對(duì)于生殖細(xì)胞的概念。它是一類(lèi)細(xì)胞，其遺傳信息不會(huì)像生殖細(xì)胞那樣遺傳給下一代。

“體細(xì)胞是執(zhí)行特殊功能的，比如紅細(xì)胞是執(zhí)行運(yùn)氧功能的，免疫細(xì)胞是執(zhí)行免疫防御功能的，它們不具有發(fā)育的特性。但有部分體細(xì)胞可以在體外進(jìn)行培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)無(wú)限增殖，可以拿到無(wú)數(shù)的體細(xì)胞?！敝锌圃荷窠?jīng)科學(xué)研究所非人靈長(zhǎng)類(lèi)研究平臺(tái)主任孫強(qiáng)說(shuō)。

利用這個(gè)特點(diǎn)，體細(xì)胞克隆技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。體細(xì)胞克隆技術(shù)又可稱(chēng)體細(xì)胞核移植技術(shù)。首先，需要把動(dòng)物體細(xì)胞分離培養(yǎng)，然后再采用核移植的方法，將卵母細(xì)胞去核作為核受體，以體細(xì)胞或含少量細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞核即核質(zhì)體作為核供體，將后者移入前者中，構(gòu)建重組胚，供體核在去核卵母細(xì)胞的胞質(zhì)中重新編程，并啟動(dòng)卵裂，開(kāi)始胚胎發(fā)育過(guò)程，妊娠產(chǎn)仔。

此次“中中“和“華華”的基因，都來(lái)自同一個(gè)流產(chǎn)的雌性獼猴胎兒?？蒲腥藛T提取了這個(gè)獼猴胎兒的體細(xì)胞（非生殖細(xì)胞），通過(guò)技術(shù)手段將其細(xì)胞核“植入”若干個(gè)“摘除”了細(xì)胞核的卵母細(xì)胞。然后再通過(guò)代孕猴子孕育出“中中“和“華華”這兩只食蟹猴。

以往用普通的猴子做實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，存在兩個(gè)劣勢(shì)。

“一是猴子的繁殖力低，傳代時(shí)間長(zhǎng)。一個(gè)猴子的懷孕周期是160天，從一個(gè)小猴子出生到性成熟可以懷孕生育至少要等4年到6年時(shí)間。而建立一個(gè)基因體系的模式動(dòng)物需要繁殖近20代，相當(dāng)于要花費(fèi)百年時(shí)間，誰(shuí)也等不起。改用體細(xì)胞來(lái)繁殖，猴子的繁殖周期可以縮短到8至10個(gè)月。二是遺傳背景復(fù)雜。因?yàn)楹镒拥母赣H母親都不一樣，其基因來(lái)源不一樣，遺傳背景就不一樣，這樣個(gè)體差異大，對(duì)實(shí)驗(yàn)干擾就會(huì)比較大。”孫強(qiáng)說(shuō)。

基于此，一直以來(lái)世界各國(guó)的科研人員都在想辦法攻克這個(gè)難題。世界上很多優(yōu)秀的生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室都嘗試過(guò)，很多連囊胚都很難獲得。2003年，權(quán)威學(xué)術(shù)期刊《科學(xué)》發(fā)表了一篇美國(guó)匹茲堡大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究人員的論文，論文稱(chēng)，用現(xiàn)有技術(shù)克隆靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物“是行不通的”。

最接近成功的一次實(shí)驗(yàn)發(fā)生在2010年。美國(guó)俄勒岡靈長(zhǎng)類(lèi)研究中心的著名科學(xué)家米塔利波夫率領(lǐng)團(tuán)隊(duì)成功移植了克隆猴胚胎，但胚胎發(fā)育至81天，以流產(chǎn)告終。

2012年，體細(xì)胞重編程技術(shù)獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。就在那一年，蒲慕明和同事們?cè)谡憬瓰蹑?zhèn)舉行的非人靈長(zhǎng)類(lèi)研究小型專(zhuān)題研討會(huì)上提出：再難也要把體細(xì)胞克隆猴做出來(lái)！

當(dāng)蒲慕明將攻克體細(xì)胞克隆猴的任務(wù)交給孫強(qiáng)時(shí)，孫強(qiáng)認(rèn)為成功的希望并不大，但他還是接下這個(gè)“不可能的任務(wù)”，開(kāi)始了艱難探索。讓人驚嘆的是，這對(duì)取得重大科學(xué)突破的師生——孫強(qiáng)和劉真，都是從未喝過(guò)“洋墨水”的本土人才。

當(dāng)時(shí)，劉真還只是一名二年級(jí)的碩士研究生。2016年，劉真博士畢業(yè)時(shí)，已經(jīng)因自閉癥猴子的研究，在英國(guó)《自然》雜志上發(fā)表過(guò)一篇論文。原本，以這樣的條件，申請(qǐng)世界上任何一個(gè)一流實(shí)驗(yàn)室的博士后，他都可以順利成行。而劉真卻決定留在神經(jīng)所位于蘇州西山的非人靈長(zhǎng)類(lèi)研究平臺(tái)，與導(dǎo)師孫強(qiáng)一起挑戰(zhàn)這個(gè)世界級(jí)難題。

蒲慕明說(shuō)，劉真做了一個(gè)正確的選擇。因?yàn)樗ピ俸玫膶?shí)驗(yàn)室，它們都不會(huì)把一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)如此巨大的課題，交給一個(gè)初來(lái)乍到的博士后去做。不過(guò)，為了讓劉真能夠安心留下，神經(jīng)所特事特辦，給了他超出一般博士后的優(yōu)厚待遇。蒲慕明認(rèn)為，體細(xì)胞克隆猴5年攻關(guān)成功的關(guān)鍵，就在于孫強(qiáng)領(lǐng)導(dǎo)了一支精誠(chéng)合作、刻苦耐勞、堅(jiān)持不懈的團(tuán)隊(duì)。endprint

為此，蒲慕明特別呼吁國(guó)家在“青年千人”計(jì)劃之外，制定相應(yīng)的人才政策吸引本土優(yōu)秀青年留在國(guó)內(nèi)做研究。他說(shuō)，現(xiàn)在優(yōu)秀的博士生總希望能夠去國(guó)外優(yōu)秀實(shí)驗(yàn)室，然后作為“青年千人”被引進(jìn)回國(guó)，這樣就能獲得更好的學(xué)術(shù)地位和待遇，而這等于讓優(yōu)秀青年科研人才將生命中最旺盛的創(chuàng)新精力發(fā)揮在了祖國(guó)之外。

“為什么我們不能讓他們留在國(guó)內(nèi)呢？我敢說(shuō)，如果沒(méi)有中國(guó)留學(xué)生，美國(guó)很多實(shí)驗(yàn)室的創(chuàng)新活力都將打折?！逼涯矫髡f(shuō)，中國(guó)的科研條件已經(jīng)不比國(guó)外差，是時(shí)候調(diào)整人才政策，吸引更多優(yōu)秀的青年科學(xué)家留在國(guó)內(nèi)做博士后，把他們的“最強(qiáng)創(chuàng)造力”用在中國(guó)創(chuàng)新上。

梳理孫強(qiáng)團(tuán)隊(duì)在《細(xì)胞》雜志上的論文細(xì)節(jié)，我們可以看到團(tuán)隊(duì)其實(shí)是嘗試了兩種體細(xì)胞。一種是猴胎兒成纖維細(xì)胞，另一種是猴卵丘細(xì)胞（位于卵丘的卵泡細(xì)胞）。利用猴胎兒成纖維細(xì)胞的一組中，研究人員將獲得的79個(gè)克隆胚胎（處于2細(xì)胞至囊胚期）移植入21只代孕母猴中，最終有6只代孕母猴成功懷孕，共攜帶5個(gè)胎兒（有一個(gè)懷孕的是雙胞胎），另外兩只僅攜帶了孕囊（gestational sacs）。4只代孕成功的母猴有兩只流產(chǎn)，剩下兩只正常懷孕超過(guò)140天，然后通過(guò)剖腹產(chǎn)手段獲得兩只存活的幸運(yùn)克隆猴“中中”和“華華”。

而利用猴卵丘細(xì)胞的一組中，最終有兩只胎兒發(fā)育超過(guò)了130天，通過(guò)剖腹產(chǎn)手術(shù)出生后不久就死亡了（分別在出生3小時(shí)和30小時(shí)后死亡）。

可以說(shuō)，“中中”和“華華”的順利誕生、健康成長(zhǎng)離不開(kāi)科研人員、獸醫(yī)、護(hù)理員無(wú)微不至的照料?！皥F(tuán)隊(duì)成員照顧一只猴子，真的就跟照顧一個(gè)孩子似的。”

給猴子接生，相當(dāng)于給人類(lèi)嬰兒接生，工作量一點(diǎn)也不小。為了不讓任何一只如國(guó)寶般珍貴的體細(xì)胞克隆猴幼崽臨產(chǎn)夭折，科研人員們更是24小時(shí)不間斷地輪流觀察，并發(fā)明了獨(dú)特的微信“打卡”法，每半小時(shí)向主管報(bào)告一次，以保證觀測(cè)員的清醒狀態(tài)。一位科研人員發(fā)朋友圈說(shuō)，晚上睡覺(jué)最怕聽(tīng)到電話鈴響，“這意味著猴子們又出狀況了?！睂O強(qiáng)說(shuō)，那里條件十分艱苦，十幾個(gè)人輪流買(mǎi)菜做飯，忙起來(lái)連春節(jié)也不能回家。

正是科研團(tuán)隊(duì)通過(guò)5年的不斷攻關(guān)，嘔心瀝血，在經(jīng)歷了無(wú)數(shù)次失敗和許多方法的改進(jìn)之后，才最終獲得成功。

克隆猴子到底有多難？

早在1999年，時(shí)任中國(guó)科學(xué)院院長(zhǎng)路甬祥即邀請(qǐng)國(guó)際神經(jīng)科學(xué)界的著名科學(xué)家蒲慕明回國(guó)，組建與國(guó)際接軌的全新科研機(jī)構(gòu)——中國(guó)科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所。蒲慕明說(shuō)，神經(jīng)所近年來(lái)在世界上的確已經(jīng)相當(dāng)有名，但要成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的領(lǐng)跑者，必須要有不斷產(chǎn)生重大突破的持續(xù)創(chuàng)新力。

何為重大突破？開(kāi)創(chuàng)新的研究領(lǐng)域，或者在現(xiàn)有領(lǐng)域中取得里程碑式的成果——世界頂尖的科研機(jī)構(gòu)都是如此。每個(gè)科研領(lǐng)域都有眾所周知的重大未解難題，能在一個(gè)領(lǐng)域不斷產(chǎn)生重大突破，才是該領(lǐng)域的領(lǐng)跑者。在蒲慕明看來(lái)，孫強(qiáng)團(tuán)隊(duì)的體細(xì)胞克隆猴成果就是生命科學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的一次重大突破。它標(biāo)志著一個(gè)嶄新時(shí)代的誕生：幾年后，一大群具有相同遺傳背景的實(shí)驗(yàn)猴，將成為生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)和新藥研發(fā)的人類(lèi)新替身。

孫強(qiáng)團(tuán)隊(duì)經(jīng)過(guò)5年的研究分析認(rèn)為，體細(xì)胞克隆的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)主要分為四個(gè)階段：胚胎構(gòu)建、激活、核基因啟動(dòng)，以及著床后發(fā)育。其中，前三個(gè)階段，也就是胚胎細(xì)胞從一個(gè)細(xì)胞依次分裂成2、4、8個(gè)細(xì)胞的過(guò)程是最關(guān)鍵的。

孫強(qiáng)介紹，克隆猴主要有三個(gè)難點(diǎn)。難點(diǎn)之一是細(xì)胞核不易識(shí)別，“去核”難度大。作為受體的卵母細(xì)胞，必須先把細(xì)胞核“摘除”，才能容納體細(xì)胞的細(xì)胞核這個(gè)“外來(lái)戶(hù)”。但是，猴的卵母細(xì)胞核去核難度非常大。

孫強(qiáng)團(tuán)隊(duì)中，博士后劉真是“去核”的主要操作者。為了能在去核過(guò)程中以最短時(shí)間內(nèi)、用最小損耗完成“去核”工作，減少對(duì)卵母細(xì)胞的損害，劉真苦練一年半技術(shù)，經(jīng)過(guò)“千錘百煉”，如今的他可以在閃爍的偏振光源下，只用52秒就能以極小的損傷為6個(gè)卵母細(xì)胞去核，還能在15秒內(nèi)將體細(xì)胞的細(xì)胞核移植到卵母細(xì)胞內(nèi)——這項(xiàng)技術(shù)上，他絕對(duì)算得上世界冠軍。

難點(diǎn)之二，是卵細(xì)胞容易提前激活?？寺∵^(guò)程中，體細(xì)胞的細(xì)胞核進(jìn)入卵細(xì)胞時(shí)，需先“喚醒”卵細(xì)胞，然后才啟動(dòng)一系列發(fā)育“程序”。因此，“喚醒”的時(shí)機(jī)要求非常精準(zhǔn)。但是，使用傳統(tǒng)方式，猴的卵細(xì)胞很容易被提前“喚醒”，往往導(dǎo)致克隆“程序”無(wú)法正常啟動(dòng)。只要操作上稍一不小心，卵母細(xì)胞就可能被激活，然后它就會(huì)先開(kāi)始自主卵裂，體細(xì)胞就跟不上了，最后導(dǎo)致這個(gè)卵無(wú)法發(fā)育。

難點(diǎn)之三，是體細(xì)胞克隆胚胎的發(fā)育效率低。被轉(zhuǎn)移到卵細(xì)胞里的細(xì)胞核，突然要扮演受精卵的角色，“趕鴨子上架”很不適應(yīng)，需要科學(xué)家采取多種手段“保駕護(hù)航”。如果“保駕”不力，絕大多數(shù)克隆胚胎都難以正常發(fā)育，往往胎死腹中。

為此，團(tuán)隊(duì)成員除了進(jìn)行猴體細(xì)胞核移植技術(shù)的訓(xùn)練之外，還通過(guò)不斷嘗試優(yōu)化體細(xì)胞克隆胚胎的激活和培養(yǎng)體系。“同行的研究揭示了胚胎早期組蛋白修飾對(duì)胚胎發(fā)育至關(guān)重要，去乙酰化酶抑制劑TSA和組蛋白去甲基化酶KDM家族能有效提高克隆胚胎的囊胚發(fā)育率?！睂O強(qiáng)說(shuō)，“我們?cè)谑承泛矬w細(xì)胞核移植體系中找到了TSA和Kdm4d的理想濃度組合，囊胚率一下子提高到46%，優(yōu)質(zhì)率也從7%提升到30%。并且利用卵丘顆粒細(xì)胞和成纖維細(xì)胞為供體做了大量的實(shí)驗(yàn)，終于實(shí)現(xiàn)了一個(gè)最重要物種的克隆?！?/p>

通過(guò)DNA指紋鑒定，“中中”和“華華”的核基因組信息與體細(xì)胞供體完全一致，證明姐妹倆都是正宗的克隆猴。

孫強(qiáng)表示，此次6只猴子代孕，生出2個(gè)克隆猴子，基本上達(dá)到了自然繁殖率的一半水平。未來(lái)要在目前取得成功的基礎(chǔ)上，著力提高效率，以滿(mǎn)足實(shí)際應(yīng)用需求。

克隆猴已經(jīng)誕生，那么是否意味著克隆人離我們已經(jīng)不遠(yuǎn)了呢？蒲慕明與孫強(qiáng)很堅(jiān)定地說(shuō)了“不”。蒲慕明介紹，體細(xì)胞克隆猴技術(shù)的突破，表明理論上克隆人的技術(shù)障礙基本去除，但是做克隆猴的目的完全是為了建立動(dòng)物模型來(lái)幫助治療人類(lèi)的各種疾病，不僅沒(méi)有必要進(jìn)行克隆人的研究，而社會(huì)的倫理道德也不允許克隆人。

模型動(dòng)物的巨大價(jià)值

“克隆猴的誕生意味著中國(guó)將率先建立起可有效模擬人類(lèi)疾病的動(dòng)物模型?！睂O強(qiáng)說(shuō)，這既能滿(mǎn)足腦疾病和腦高級(jí)認(rèn)知功能研究的迫切需要，又可廣泛應(yīng)用于新藥測(cè)試。

孫強(qiáng)介紹，如果實(shí)驗(yàn)對(duì)象的遺傳背景不同，“實(shí)驗(yàn)組”和“對(duì)照組”的說(shuō)服力就不夠強(qiáng)。傳統(tǒng)醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)大量采用小鼠，很大程度上是因?yàn)槭箢?lèi)可通過(guò)快速近親繁殖，培育出大量非常相似的小鼠。

但由于小鼠和人類(lèi)相差太遠(yuǎn)，針對(duì)小鼠研發(fā)的藥物在人體檢測(cè)時(shí)大都無(wú)效或有副作用。據(jù)了解，這是目前絕大多數(shù)腦疾病研究無(wú)法取得突破的一個(gè)主要原因。

談到體細(xì)胞克隆猴構(gòu)建成功的意義，蒲慕明表示，首先證實(shí)了獼猴可以用體細(xì)胞來(lái)克隆，二是獼猴可以成為真正有用的動(dòng)物模型。

“克隆猴遺傳背景相同，可以減少個(gè)體間差異對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾，大大減少了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用數(shù)量。同時(shí)，通過(guò)體細(xì)胞克隆技術(shù)，模型猴制備時(shí)間縮短到一年內(nèi)，復(fù)雜和精準(zhǔn)的基因編輯可以在體外培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行?！逼涯矫髡f(shuō)。

此外，體細(xì)胞克隆猴的成功，將推動(dòng)我國(guó)率先發(fā)展出基于非人靈長(zhǎng)類(lèi)疾病動(dòng)物模型的全新醫(yī)藥研發(fā)產(chǎn)業(yè)鏈，促進(jìn)針對(duì)阿爾茨海默病、自閉癥等腦疾病，以及免疫缺陷、腫瘤、代謝性疾病的新藥研發(fā)進(jìn)程。

美國(guó)的杰克森實(shí)驗(yàn)室建立于1929年，是世界上最大的模式動(dòng)物研發(fā)基地和銷(xiāo)售公司，為國(guó)際生物醫(yī)學(xué)界培養(yǎng)并出售7000多種基因編輯小鼠品系?！暗冗@項(xiàng)技術(shù)成熟后，未來(lái)，我國(guó)也可建成以非人靈長(zhǎng)類(lèi)為模型的主要研發(fā)基地和產(chǎn)業(yè)鏈?！逼涯矫髡f(shuō)：“以我國(guó)科學(xué)家為主導(dǎo)的靈長(zhǎng)類(lèi)全腦圖譜計(jì)劃的實(shí)施和靈長(zhǎng)類(lèi)腦科學(xué)的前沿研究，將進(jìn)一步使我國(guó)成為世界腦科學(xué)人才的匯聚高地?！眅ndprint