高麗 劉艾林 杜冠華

隨著分子生物學、X射線晶體學的發(fā)展，大量與疾病相關的生物大分子的三維結構被確定；計算科學的迅速崛起使得數(shù)據(jù)挖掘、機器學習等技術快速發(fā)展。在這兩方面的推動下，計算機輔助藥物設計 （computer aided drug design，CADD）應運而生，并滲透到新藥研發(fā)的各個環(huán)節(jié)。CADD可以提高藥物研發(fā)的成功率，降低研發(fā)成本，縮短研發(fā)周期，是目前創(chuàng)新藥物研究的核心技術之一。

CADD以計算機作為操作界面和輔助手段，利用計算化學、分子圖形學等技術，將理論思維形象化，使藥物設計更加直觀、便捷和有效。經(jīng)過50年的發(fā)展和應用，CADD在新藥研發(fā)過程的不同階段均產(chǎn)生了重要作用。筆者以CADD的應用為基礎，探討CADD在藥物靶點的發(fā)現(xiàn)與確證、先導化合物的發(fā)現(xiàn)與優(yōu)化、藥物的藥動學行為及毒理學前景的評價等方面的應用進展，說明CADD的重要價值和潛在優(yōu)勢，及其面臨的挑戰(zhàn)和發(fā)展前景。

1 在藥物靶點的發(fā)現(xiàn)與確證中的應用

靶點的發(fā)現(xiàn)與確證是現(xiàn)代新藥研發(fā)的第一步，也是新藥創(chuàng)制過程中的瓶頸之一。CADD的應用可以加快靶點發(fā)現(xiàn)的速度，提高靶點發(fā)現(xiàn)的準確度，從而推進新藥研發(fā)。

1.1 生物信息學的應用

生物信息學通過計算機對基因組學、蛋白質組學等數(shù)據(jù)資源進行采集、存儲、分析、處理，并開發(fā)出來一些實用的生物信息學軟件，如多重序列比對軟件BLAST，CLUSTAL，PROMALS3D等將靶點序列與數(shù)據(jù)庫中的同源序列進行比對，實現(xiàn)對靶點的分類；PPT-DB數(shù)據(jù)庫可以預測蛋白質的二級結構、等電點、疏水性等理化性質，實現(xiàn)對靶點的識別。此外，運用生物信息學可以整合分析大量的臨床實驗數(shù)據(jù)，為靶點的確證提供新的視角。

Chhabra等運用BLASTp將產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）的2558個基因與人的基因組進行序列比對，將比對結果中與人同源性低的基因在必需基因數(shù)據(jù)庫（database of essential genes，DEG）中進行比對分析，從中發(fā)現(xiàn)ABC轉運蛋白等5個抗菌藥物作用靶點，從而為廣譜抗菌藥的開發(fā)提供了重要的參考信息。

1.2 支持向量機算法的應用

一般而言，生物信息學輔助藥物靶點發(fā)現(xiàn)與確證主要通過比對氨基酸序列的相似性來實現(xiàn)，因此很難發(fā)現(xiàn)與已知靶點同源性低的“新型”藥物靶點?；跈C器學習和結構風險最小化原理開發(fā)的支持向量機（support vector machines，SVM）方法，通過建立人工智能模型區(qū)分成藥性和非成藥性蛋白，預測“新型”藥物靶點。

最近，Han等應用SVM方法對1484個成藥性蛋白和6637個非成藥性蛋白進行預測，其準確率分別達到64.1%～71.0%和85.0%～85.8%，其中包括“新型”藥物靶點，這說明SVM技術對靶點尤其是“新型”藥物靶點成藥性具有較好的預測能力。

1.3 反向分子對接技術的應用

反向分子對接是將同一個活性分子分別對接到多個蛋白的活性位點，以確定該分子潛在藥物靶點的技術。該技術能夠高效、大規(guī)模進行靶點的確定和驗證，預測與毒性相關的靶點。

最近Bernard等運用SELNERGYTM反向分子對接軟件發(fā)現(xiàn)了托非索泮（tofisopam）的作用靶點。托非索泮是一種外消旋體，作為抗焦慮藥于20世紀80年代在亞洲和歐洲上市，但其生物學靶點不明確。反向分子對接結果顯示，托非索泮的作用靶點是磷酸二酯酶4（phosphodiesterase 4，PDE4）。該藥物的S型異構體與已上市的PDE4抑制劑咯利普蘭（rolipram）相比，抑制作用更強，且不存在嘔吐的副作用，這為開發(fā)高選擇性的PDE4抑制劑提供了廣闊的應用前景。

2 在先導化合物的發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化中的應用

先導化合物的發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化是創(chuàng)新藥物研究成敗的關鍵。長期以來，先導化合物的發(fā)現(xiàn)依賴藥物化學家合成大量的化合物以及藥理學家運用各種模型進行大量篩選。CADD的應用，包括基于結構的藥物設計（structure-based drug design，SBDD）、基于配體的藥物設計（ligand-based drug design，LBDD）、高通量虛擬篩選（high-throughput virtual screening，HTVS）等技術，突破了傳統(tǒng)的先導物發(fā)現(xiàn)模式，極大地促進了先導化合物發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化。

2.1 基于結構的藥物設計

基于結構的藥物設計（SBDD）是根據(jù)藥物靶點結構，研究受體和小分子之間的相互作用，設計與活性口袋互補的新分子或尋找新型先導化合物的技術。SBDD方法包括分子對接、全新藥物設計等，常用的分子對接軟件有Autodock、Gold、Dock、FlexX、Glide、MOE等。

目前國內外應用SBDD技術已經(jīng)取得了非常顯著的成績，在該技術的輔助下，許多藥物已成功上市或進入臨床研究，近年來SBDD技術應用成功的典型實例；對于卡托普利、扎那米韋的成功研發(fā)過程這里分別作一簡述。

2.1.1 抗高血壓藥物卡托普利（captopril）的發(fā)現(xiàn)血管緊張素轉化酶（angiotensin-convertingenzyme，ACE）是一種Zn2+依賴型羧肽酶，對血壓起重要的調節(jié)作用。羧肽酶A與ACE結構相近，且羧肽酶A的活性位點、特異性底物及其抑制劑在當時已被充分認識，而ACE的活性位點尚不明確。因此，研究人員針對羧肽酶A的活性位點，ACE及其底物結構建立了ACE活性位點假說。

對比兩者的活性位點發(fā)現(xiàn)，ACE與羧肽酶A的活性位點都包含與底物羧酸陰離子末端結合的陽離子位點和Zn2＋，主要差別在于兩者的距離不同。ACE中陽離子位點與Zn2＋相距二個氨基酸殘基的距離，而羧肽酶A中只相距一個氨基酸殘基的距離。

L-芐基琥珀酸，是有效的羧肽酶A抑制劑，其兩個羧基分別與陽離子位點和Zn2＋作用。根據(jù)ACE和L-芐基琥珀酸的結構，適當延長兩個羧基之間的距離，設計出琥珀酰脯氨酸。結構改造發(fā)現(xiàn)，D構型2-甲基取代的琥珀酰脯氨酸衍生物對ACE的抑制活性增強了15倍，表明立體特異性的甲基取代使抑制劑與酶的作用顯著增強。構效關系研究發(fā)現(xiàn)，當化合物2的末端羧基被巰基取代時，抑制活性變?yōu)樵瓉淼?000倍，由此發(fā)現(xiàn)了卡托普利，1981年被FDA批準為第一個應用于臨床的ACE抑制劑，用于治療高血壓。

2.1.2 神經(jīng)氨酸酶抑制劑扎那米韋（zanamivir）的開發(fā)流感是一種常見的病毒感染性疾病，其傳染性強，傳播速度快，易發(fā)生大范圍流行。據(jù)統(tǒng)計，1976—2007年美國由于季節(jié)性流感的平均年死亡人數(shù)為23607人。時至今日，流感病毒依然猖獗，開發(fā)抗流感藥物成為全世界藥物研發(fā)的重要課題。流感病毒神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）又稱唾液酸酶，能催化裂解唾液酸末端和相鄰糖基之間的糖苷鍵，促進病毒從感染的細胞中釋放，繼而感染新的宿主細胞。因此，抑制NA即可干擾或阻止流感病毒的復制，達到防治流感的目的。NA晶體結構于1983年被確定，之后運用探針技術及計算軟件GRID確定了其結合位點和結合能。Glaxo Wellcom公司應用分子模擬和計算化學方法，設計出了扎那米韋。

扎那米韋的發(fā)現(xiàn)是成功應用計算機輔助藥物設計的典范，其開發(fā)的思路受到廣泛重視。首先，研究人員以已知的NA抑制劑2-去氧-2,3-去氫-N-乙?；窠?jīng)氨酸（Neu5Ac2en）為設計模板，根據(jù)Neu5Ac2en中C4位OH與NA活性位點的結合特征，用氨基取代羥基得到2-去氧-2,3-去氫-N-乙酰基神經(jīng)氨酸衍生物（4-amino-4-deoxy-Neu5Ac2en），該化合物能與Glu119形成鹽橋，因此與NA具有更高的親和力；在此基礎上，用胍基取代氨基，得到扎那米韋，扎那米韋的胍基能同時與Glu119和Glu227相互作用，與NA的親和力顯著增強，Ki達到2×10－10mol·L－1。實驗證明，扎那米韋能夠有效抑制A型和B型流感病毒，于1999年8月由美國FDA批準上市。

2.2 基于配體的藥物設計

基于配體的藥物設計（LBDD）是從已有的活性小分子結構出發(fā)，通過建立藥效團模型（pharmacophore model）或定量構效關系（quantitative structure-activity relationship，QSAR），預測新化合物活性或指導原有化合物結構改良?；谂潴w的藥物設計方法主要有藥效團模型構建和定量構效關系分析。

2.2.1 藥效團模型的構建藥效團模型的構建是先導化合物發(fā)現(xiàn)的重要方法，有基于配體和受體兩種方式?；谂潴w的藥效團模型的建立是從一系列活性化合物結構出發(fā)，確定其生物活性必需的疏水、氫鍵等特征元素；基于受體的藥效團模型通過探測生物大分子與配體的相互作用點來建立。藥效團模型建立之后，通過對數(shù)據(jù)庫中化合物進行3D搜索，可以富集活性化合物，從而發(fā)現(xiàn)新的活性分子。目前，常用的構建藥效團的軟件有DISCO、HypoGen、GASP、PHASE等。

藥效團模型構建的藥物設計方法已廣泛應用于藥物研發(fā)中，也有很多成功的例子。CB2受體與慢性痛、炎癥、動脈粥樣硬化等疾病密切相關，Markt等建立藥效團模型并應用該模型對922944個化合物進行虛擬篩選，得到14個分子。經(jīng)活性驗證有7個化合物的Ki值在25 μmol·L－1以下，包括CB2受體的部分激動劑、反向激動劑和拮抗劑，新型母核結構也隨之確定，奠定了開發(fā)CB2受體的活性配體的基礎。

2.2.2 定量構效關系分析定量構效關系分析一般基于有相同母體的同系物分子，采用數(shù)理統(tǒng)計的方法構建方程，分析化合物的生物學活性與其結構的定量變化規(guī)律，預測改造后的化合物活性，用于先導化合物的優(yōu)化。構效關系通常分為2D-QSAR和3D-QSAR，目前，QSAR正向多維化方向發(fā)展，引入了4D-QSAR和5D-QSAR的概念，以克服3D-QSAR中分子排列和構象選擇等問題。

HIV整合酶催化病毒DNA插入到宿主染色體內，是HIV復制必需的基本酶之一，由于只存在于病毒體內，因此是十分有前景的抗HIV藥物設計靶點。整合酶抑制劑通過抑制整合酶，能有效抑制HIV復制，為抗HIV藥物的開發(fā)指明了方向。Kuo等運用3D-QSAR中的比較分子場分析法（comparative molecular field analysis，CoMFA）和比較相似因子分析法（comparative molecular similarity indices analysis，CoMSIA）建立了可靠的活性預測模型，用于設計新型整合酶抑制劑。

乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）抑制劑是治療老年性癡呆的一線臨床藥物，本實驗室Liu等應用CoMFA方法，對30多個新型活性化合物進行構效關系分析，建立了3D-QSAR模型，為設計高活性的乙酰膽堿酯酶抑制劑提供重要線索。

2.3 高通量虛擬篩選

高通量虛擬篩選（HTVS）針對靶點的三維結構或已建立的藥效團模型、QSAR模型，從化合物數(shù)據(jù)庫中，將符合條件的小分子挑選出來，進行生物活性測試，成為先導化合物發(fā)現(xiàn)的重要手段。

近年來，采用HTVS技術發(fā)現(xiàn)的先導化合物的實例迅速增長。如趨化因子受體5（CCR5）激動劑，酪蛋白激酶2（CK2）抑制劑等。NA是抗流感的作用靶點，本實驗室Liu等應用虛擬篩選技術，對10000個化合物進行NA抑制作用的虛擬篩選評價，選擇結果較好的160個化合物用高通量篩選技術進行NA抑制活性評價，最終發(fā)現(xiàn)3個有顯著活性的NA抑制劑，其IC50均小于3 μmol·L－1。

上述各種藥物設計方法并不是相互獨立的，在實際應用過程中需要根據(jù)獲得的信息，綜合運用多種方法，來實現(xiàn)先導化合物的發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化。LY-517717和NVP-AUY922的發(fā)現(xiàn)綜合運用了SBDD和HTVS技術；基于受體和配體相結合的虛擬篩選方法與僅用一種方法相比，能夠獲得更為可靠的結果，已成功應用于先導化合物的發(fā)現(xiàn)，如D3受體激動劑，MDM2-p53抑制劑等。

3 計算機輔助ADME/T研究

藥物代謝動力學（pharmacokinetics，PK）和毒理學（toxicity，T）是藥物臨床前研究的重要組成部分，其中PK反映了藥物在生物體內吸收（absorption，A）、分布（distribution，D）、代謝（metabolism，M）、排泄（excretion，E）的規(guī)律。在過去的新藥創(chuàng)制過程中，約60%的藥物由于ADME性質不佳或毒性過大而導致開發(fā)失敗，為此研究者付出了沉重的資金和時間代價。

基于QSAR、定量結構性質關系（quantitative structure property relationship，QSPR）、定量結構—毒性效應關系（quantitative structuretoxicity relationships，QSTR）等理論基礎，ADME/T性質預測能將無成藥前景的藥物在早期排除在研究范圍之外，從而降低研發(fā)成本，提高研發(fā)效率。

目前，常用的藥物代謝產(chǎn)物預測軟件有TIMES、METEOR、ADMET Predictor等。METEOR預測9個上市藥物的代謝產(chǎn)物，與實驗結果完全吻合，說明其有較好的預測能力。DEREK、TOPKAT等軟件可以預測藥物的致癌性、誘變性、皮膚敏化作用、動物體內難以檢測的反應（如惡心、頭痛、認知缺損）等，其中DEREK對誘變性預測的準確度在70%以上。

4 面臨的挑戰(zhàn)

CADD在新藥研發(fā)中的應用已經(jīng)取得了可喜的成績，其可行性強，發(fā)展前景廣闊。然而，CADD作為一種新型的技術仍然存在許多局限性，有待于改進和完善。

4.1 分子對接中存在的問題

分子對接時受體柔性，水分子的處理，配體的異構化、離子化等均會影響對接的準確性。① 受體柔性的處理。在配體對接過程中許多蛋白會經(jīng)歷骨架或側鏈的移動，不同配體對接同一蛋白時蛋白采取的構象也可能不同，因此考慮受體的柔性是非常重要的。隨著軟件的不斷開發(fā)，有些軟件如QXP、Schrodinger公司的Induced-fitdocking（IFD）模塊等已將蛋白柔性考慮在內。與剛性對接結果相比，應用IFD對21個蛋白-配體復合物進行柔性對接后，其RMSD均值從5.5×10－10m減小到1.4×10－10m。② 水分子的處理。水分子在蛋白-配體相互識別過程中起著關鍵作用，因此在對接時不能忽略水介導的相互作用，然而能夠很好地處理水分子是十分困難的。③ 配體的異構化和離子化。分子對接時，配體會形成多種形式的異構化和離子化狀態(tài)，選擇哪種構象的配體作為對接結果仍然是個難題。

4.2 藥效團模型構建中存在的問題

配體構象的產(chǎn)生和訓練集化合物的選擇影響基于配體的藥效團模型構建，受體活性位點的柔性和個數(shù)影響基于受體的藥效團模型構建。① 配體構象的產(chǎn)生。多數(shù)情況下，配體分子是柔性的，如何高效、準確地產(chǎn)生配體所有可能構象是藥效團模建中的主要難題之一。最近開發(fā)的構象搜索算法CAESAR可以有效排除系統(tǒng)搜尋過程中由于拓撲對稱產(chǎn)生的重復構象，與Catalyst/FAST相比，速度提高了5～10倍。② 訓練集化合物的數(shù)目和結構多樣性。應用同一軟件的同一算法，選擇不同的訓練集可能產(chǎn)生完全不同的藥效團模型，因此要合理選擇訓練集化合物，并理性分析藥效團數(shù)據(jù)搜索的結果。③ 受體活性位點的柔性和個數(shù)影響基于受體的藥效團模建的準確性。

5 結語

綜上所述，CADD在新藥研發(fā)中的優(yōu)勢已經(jīng)日益凸顯。CADD為新藥研發(fā)開辟了新的天地，我們不必盲目地合成大量的化合物，做大量的生物活性測試，既節(jié)省了原料和動物，又節(jié)約了時間，提高了研發(fā)效率。同時，我們應該認識到CADD是新藥研發(fā)過程中的重要輔助方法之一，它不是萬能的，計算結果不能取代實驗數(shù)據(jù)，藥物設計結果最終還需要實驗的驗證，并借助實驗結果來改進和完善CADD方法與策略。無論如何，CADD為新藥研發(fā)提供了一種新的思維模式，并滲透到新藥研發(fā)的各個階段，其可行性很強。隨著化學計算理論方法的不斷完善以及CADD計算軟件的不斷改進，CADD在新藥研發(fā)中必將得到更廣泛的應用，以更好地推動新藥研發(fā)。

（摘自《中國藥學雜志》2011年第9期）