幾種因素對(duì)懸浮培養(yǎng)白色紫錐菊不定根生物量和有效物質(zhì)積累的影響?yīng)?/h1>
2018-02-06 07:22王洪秋李賀吳春華
江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年15期
王洪秋 李賀 吳春華
摘要：為優(yōu)化白色紫錐菊不定根懸浮培養(yǎng)體系，從而獲得較多有效物質(zhì)的積累，以白色紫錐菊不定根為試驗(yàn)材料，探究培養(yǎng)基中PO43-濃度、總氮濃度、NO3--NH4+對(duì)白色紫錐菊不定根生物量及有效物質(zhì)積累的影響。結(jié)果表明：當(dāng)培養(yǎng)基中PO43-濃度為0.94 mmol/L、總氮濃度為45 mmol/L、NO3--NH4+為37.5-7.5 mmol/L時(shí)，懸浮培養(yǎng)白色紫錐菊不定根生物量及有效物質(zhì)均達(dá)到最大值，其中酚、黃酮生產(chǎn)量分別為253.78、178.08 mg/L。因此，通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基成分配比，可提供生物量及有效物質(zhì)含量高的不定根為原材料，為進(jìn)一步大規(guī)模培養(yǎng)白色紫錐菊不定根奠定了理論基礎(chǔ)。
關(guān)鍵詞：懸浮培養(yǎng)；白色紫錐菊；不定根；酚；黃酮；生物量；有效物質(zhì)積累
中圖分類號(hào)： S682.1+10.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A
文章編號(hào)：1002-1302（2017）15-0125-03
白色紫錐菊（Echinacea pallida）屬菊科松果菊屬，多年生草本植物，為原產(chǎn)于北美地區(qū)的一種藥用植物[1]，它被國(guó)際公認(rèn)為免疫增強(qiáng)劑[2]。白色紫錐菊作為中草藥使用，相對(duì)于其他藥用植物比較安全[3]，它的藥用功效主要為抗炎、抗菌、抗病毒、增強(qiáng)免疫等。白色紫錐菊含有酚類、黃酮類、咖啡酸類衍生物、多種烷基酰胺類化合物、揮發(fā)油、多糖等多種有效活性成分。其中，含有的多酚類物質(zhì)具有抗炎活性，可以抑制透明質(zhì)酸酶和環(huán)氧合酶等酶類，阻斷前列腺素的合成，從而減少炎癥細(xì)胞的入侵。多酚類物質(zhì)也能通過清除活性氧，使自由基不損傷皮膚膠元蛋白[4]。此外，白色紫錐菊中還含有它特有的紫錐菊苷，具有治療糖尿病、抗腫瘤、抗衰老等作用，還對(duì)肺癌、肝癌和胃腺癌有顯著的療效[5-6]。
栽培的白色紫錐菊易受不同地區(qū)和生長(zhǎng)期等栽培條件的影響，其產(chǎn)量及品質(zhì)難以滿足需求[7]。利用植物組織培養(yǎng)手段培養(yǎng)的不定根遺傳穩(wěn)定性高、有效物質(zhì)含量穩(wěn)定，具有較高的安全性[8]，不定根培養(yǎng)成為快速獲得藥用植物活性成分的有效方法。因此，很多研究都采用這一方法進(jìn)行有效物質(zhì)的生產(chǎn)。姜銀姬等探究了東北刺人參不定根培養(yǎng)方式，發(fā)現(xiàn)懸浮培養(yǎng)與固體培養(yǎng)相比較，具有更高的皂苷含量積累[9]。在紫錐菊不定根培養(yǎng)方面，吳春華等研究了白色紫錐菊不定根培養(yǎng)基中無機(jī)鹽和蔗糖的濃度[10]。但白色紫錐菊不定根培養(yǎng)體系尚未完善。因此，本研究探究了磷濃度、總氮濃度和NO3--NH4+對(duì)不定根生長(zhǎng)以及有效物質(zhì)積累的影響，為今后以培養(yǎng)的不定根作為白色紫錐菊產(chǎn)品開發(fā)及生產(chǎn)的原材料提供理論依據(jù)。
1材料與方法
1.1試驗(yàn)材料
從大連市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院獲得白色紫錐菊不定根，2016年7月在延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院將其接種于[3/4 MS+IBA（吲哚丁酸）1 mg/L+蔗糖50 g/L+瓊脂6.8 g/L，pH值 5.8][10]固體培養(yǎng)基中，從而進(jìn)行增殖培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：暗處理，培養(yǎng)溫度為（25±1）℃。暗培養(yǎng)30 d后，取新鮮不定根切成大小約為1 cm的小段，作為試驗(yàn)材料。
1.2試驗(yàn)方法
1.2.1幾種因素對(duì)白色紫錐菊不定根生物量和有效物質(zhì)積累的影響
為探明培養(yǎng)基中PO43-濃度、總氮濃度、NO3--NH4+對(duì)懸浮培養(yǎng)白色紫錐菊不定根增殖生長(zhǎng)和有效物質(zhì)積累的影響。稱取白色紫錐菊不定根0.35 g鮮質(zhì)量（FW），接種于150 mL錐形瓶中，其中含有50 mL液體培養(yǎng)基。
PO43-濃度試驗(yàn)：將培養(yǎng)基中PO43-濃度分別設(shè)為0、0.31、0.63、0.94、1.25、1.56、1.88 mmol/L，培養(yǎng)基中IBA為 1 mg/L、蔗糖為50 g/L，pH值5.8。振蕩器轉(zhuǎn)速為 100 r/min，進(jìn)行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度設(shè)定為（25±1）℃。30 d 后測(cè)定白色紫錐菊不定根的鮮質(zhì)量、干質(zhì)量以及酚和黃酮的含量，并計(jì)算其生產(chǎn)量。
總氮濃度試驗(yàn)：將培養(yǎng)基中總氮濃度分別設(shè)置為0、15、30、45、60、75、90 mmol/L，培養(yǎng)基其他成分及培養(yǎng)條件與PO43-濃度試驗(yàn)相同。
NO3--NH4+試驗(yàn)：固定培養(yǎng)基中總氮濃度為 45 mmol/L，將培養(yǎng)基中NO3--NH4+分別設(shè)為0-45、7.5-37.5、15-30、22.5-22.5、30-15、37.5-7.5、45-0 mmol/L，培養(yǎng)基其他成分及培養(yǎng)條件與PO43-濃度試驗(yàn)相同。
1.2.2不定根生物量的測(cè)定
收獲懸浮培養(yǎng)30 d的不定根，將其用自來水沖洗干凈后，再用濾紙吸干表面水分，稱其質(zhì)量即為鮮質(zhì)量（FW）。然后將不定根放入烘干箱中，55 ℃烘干48 h，使不定根干燥至恒質(zhì)量，稱其干質(zhì)量（DW）。
1.2.3有效物質(zhì)的萃取
稱取0.2 g干燥的白色紫錐菊不定根，然后加入10 mL的80%甲醇。在常溫下，用磁力攪拌器進(jìn)行15 min萃取，然后離心10 min，將過濾后的上清液倒入容量瓶中，殘?jiān)俅斡猛环椒ㄝ腿》蛛x，最后定容至 25 mL，用于測(cè)定有效物質(zhì)含量。
1.2.4酚含量的測(cè)定
福林法（folin and Ciocalteu）：精確稱取沒食子酸25 mg，以蒸餾水為溶劑，定容至250 mL。標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度為0.1 mg/mL，分別取0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液和0.1 mL萃取液于試管中，加入蒸餾水至2.6 mL，以蒸餾水作為空白對(duì)照，再加入0.1 mL福林酚指示劑，搖勻靜止6 min后，加入0.5 mL的20% Na2CO3。在常溫下，30 min暗反應(yīng)，在760 nm處用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度。
1.2.5黃酮含量的測(cè)定
兒茶素（catechin）標(biāo)準(zhǔn)液法：精密稱取兒茶素0.04 g，加蒸餾水定容至50 mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度為0.8 mg/mL，然后分別取0.19、0.38、0.56、0.75、0.94、1.13、1.31、1.50 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液和0.25 mL萃取液于試管中，加蒸餾水至1.5 mL，蒸餾水作為空白對(duì)照，再加入0.75 mL的5% NaOH2溶液，搖勻靜止6 min后，加入0.15 mL的10% AlCl3溶液，待反應(yīng)5 min后加入0.5 mL的1 mol/L NaOH溶液，在510 nm處用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度。endprint
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栽培的白色紫錐菊易受不同地區(qū)和生長(zhǎng)期等栽培條件的影響，其產(chǎn)量及品質(zhì)難以滿足需求[7]。利用植物組織培養(yǎng)手段培養(yǎng)的不定根遺傳穩(wěn)定性高、有效物質(zhì)含量穩(wěn)定，具有較高的安全性[8]，不定根培養(yǎng)成為快速獲得藥用植物活性成分的有效方法。因此，很多研究都采用這一方法進(jìn)行有效物質(zhì)的生產(chǎn)。姜銀姬等探究了東北刺人參不定根培養(yǎng)方式，發(fā)現(xiàn)懸浮培養(yǎng)與固體培養(yǎng)相比較，具有更高的皂苷含量積累[9]。在紫錐菊不定根培養(yǎng)方面，吳春華等研究了白色紫錐菊不定根培養(yǎng)基中無機(jī)鹽和蔗糖的濃度[10]。但白色紫錐菊不定根培養(yǎng)體系尚未完善。因此，本研究探究了磷濃度、總氮濃度和NO3--NH4+對(duì)不定根生長(zhǎng)以及有效物質(zhì)積累的影響，為今后以培養(yǎng)的不定根作為白色紫錐菊產(chǎn)品開發(fā)及生產(chǎn)的原材料提供理論依據(jù)。
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1.2試驗(yàn)方法
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PO43-濃度試驗(yàn)：將培養(yǎng)基中PO43-濃度分別設(shè)為0、0.31、0.63、0.94、1.25、1.56、1.88 mmol/L，培養(yǎng)基中IBA為 1 mg/L、蔗糖為50 g/L，pH值5.8。振蕩器轉(zhuǎn)速為 100 r/min，進(jìn)行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度設(shè)定為（25±1）℃。30 d 后測(cè)定白色紫錐菊不定根的鮮質(zhì)量、干質(zhì)量以及酚和黃酮的含量，并計(jì)算其生產(chǎn)量。
總氮濃度試驗(yàn)：將培養(yǎng)基中總氮濃度分別設(shè)置為0、15、30、45、60、75、90 mmol/L，培養(yǎng)基其他成分及培養(yǎng)條件與PO43-濃度試驗(yàn)相同。
NO3--NH4+試驗(yàn)：固定培養(yǎng)基中總氮濃度為 45 mmol/L，將培養(yǎng)基中NO3--NH4+分別設(shè)為0-45、7.5-37.5、15-30、22.5-22.5、30-15、37.5-7.5、45-0 mmol/L，培養(yǎng)基其他成分及培養(yǎng)條件與PO43-濃度試驗(yàn)相同。
1.2.2不定根生物量的測(cè)定
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1.2.3有效物質(zhì)的萃取
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1.2.4酚含量的測(cè)定
福林法（folin and Ciocalteu）：精確稱取沒食子酸25 mg，以蒸餾水為溶劑，定容至250 mL。標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度為0.1 mg/mL，分別取0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液和0.1 mL萃取液于試管中，加入蒸餾水至2.6 mL，以蒸餾水作為空白對(duì)照，再加入0.1 mL福林酚指示劑，搖勻靜止6 min后，加入0.5 mL的20% Na2CO3。在常溫下，30 min暗反應(yīng)，在760 nm處用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度。
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