任子利　高卓然　李瑜鑫

摘要：為分析Ghrelin基因在藏豬與長(zhǎng)白豬胃底組織中mRNA的表達(dá)差異，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)Ghrelin基因在藏豬與長(zhǎng)白豬胃底組織中mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)分析。結(jié)果顯示，藏豬胃底組織中mRNA的表達(dá)量（0.495 8±0.023 1）顯著低于長(zhǎng)白豬（0.741 7±0.026 6）。說明Ghrelin基因在藏豬胃底組織中mRNA的低表達(dá)可能是藏豬生長(zhǎng)緩慢的原因之一，這將為提高藏豬生長(zhǎng)速度的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：Ghrelin基因；藏豬；胃底組織；mRNA表達(dá)；PCR技術(shù)

中圖分類號(hào)： Q786文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）15-0046-03

藏豬主要生活在我國(guó)青藏高原海拔2 500～4 300 m的農(nóng)區(qū)和半農(nóng)半牧區(qū)，是中國(guó)特有的能適應(yīng)高海拔地區(qū)的一個(gè)重要品種[1-2]，有“高原之珍”的美譽(yù)[3]。然而，與長(zhǎng)白豬的日增質(zhì)量達(dá)731 g相比，藏豬的生長(zhǎng)速度比較緩慢，一般18～30月齡體質(zhì)量才達(dá)50～60 kg，日增質(zhì)量只有171 g，提高藏豬的生長(zhǎng)速度已成為藏豬飼養(yǎng)中的一個(gè)關(guān)鍵問題。饑餓激素（Ghrelin）被稱為胃饑餓素、生長(zhǎng)素或生長(zhǎng)激素釋放肽，是一種由28個(gè)氨基酸組成的多肽，是生長(zhǎng)激素促分泌素受體（GHS-R）的一種內(nèi)源性配體，由日本的Kojima等于1999年從小鼠和人的胃組織中成功分離并鑒定[4]。Ghrelin及其受體在動(dòng)物體內(nèi)廣泛分布，具有調(diào)節(jié)生長(zhǎng)激素分泌、攝食、能量代謝、生殖等多種生物學(xué)作用[5-6]。在豬、羊等動(dòng)物上已證實(shí)，動(dòng)物攝食可以促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)[7-8]。模擬高原的低壓低氧環(huán)境可致大鼠血清Ghrelin水平下降，胃黏膜Ghrelin分泌減少，Ghrelin可能參與模擬低壓低氧環(huán)境中機(jī)體消化功能紊亂的調(diào)節(jié)[9]。然而，關(guān)于藏豬胃底組織中Ghrelin基因的mRNA表達(dá)水平是否與長(zhǎng)白豬有差異，目前未見相關(guān)報(bào)道。因此，本研究運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)Ghrelin基因在藏豬與長(zhǎng)白豬胃底組織中mRNA的表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)分析，以探討藏豬生長(zhǎng)緩慢的可能原因，為提高藏豬生長(zhǎng)速度的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣本采集及處理

選擇生長(zhǎng)發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)狀況正常的6月齡藏豬與3月齡長(zhǎng)白豬胃底組織樣本各12個(gè)（分別取自西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院實(shí)習(xí)基地、西藏林芝當(dāng)?shù)赝涝讏?chǎng)），取樣后將樣本迅速放入RNA樣品保存液中，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行總RNA的提取或放于-80 ℃冰箱備用。

1.1.2主要試劑與儀器設(shè)備

Trizol（碧云天生物技術(shù)研究所），Quantscript RT Kit、TransStart Top Green qPCR SuperMix（2×）（天根生物技術(shù)有限公司），2xPCRMix（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）。

PCR儀（德國(guó)Eppendorf公司），Boi-Rad凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司），CFX96突光定量實(shí)時(shí)PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司），NanoDrop ND-1000紫外分光光度計(jì)（美國(guó)NanoDrop公司），Eppendorf Centrifuge 5417R、5415R離心機(jī)（德國(guó)eppendorf公司）。

1.2引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中已公布的豬Ghrelin基因（目的基因）以及β-actin基因（持家基因）的cDNA序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)定量引物，并送交生工生物工程（上海）股份有限公司合成。2個(gè)基因的引物信息見表1。

1.3總RNA的提取與鑒定

利用Trizol一步法，按照該試劑說明書，提取各個(gè)樣本的總[CM（25]RNA。先用紫外分光光度計(jì)測(cè)總RNA濃度和純度，再用1%瓊脂糖凝膠電泳確定總RNA的完整性，若RNA的純度和完整性均符合要求，立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄或置于-80 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4反轉(zhuǎn)錄cDNA

按照Quantscript RT Kit試劑盒說明書提供的方法，將稀釋成同一濃度總RNA的各個(gè)樣品反轉(zhuǎn)成cDNA，接著進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)或置于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5基因的PCR擴(kuò)增

用梯度PCR篩選2對(duì)引物的最佳退火溫度后，以cDNA第一鏈為模板，加入引物、dNTP和2xPCRMix等，混勻后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系包括反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（cDNA）1 μL、2xPCRMix 10 μL，引物（10 μmol/L）各0.4 μL、ddH2O 8.2 μL，總體積20 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性20 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，36個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 5 min，4 ℃結(jié)束。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.6熒光定量PCR

目的基因及持家基因的熒光定量PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 15 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 10 s，65～95 ℃每增加0.5 ℃讀取熒光1次，繪制溶解曲線。熒光定量PCR反應(yīng)采用20 μL反應(yīng)體系：2X SYBR PCR Buffer 10 μL，cDNA 1 μL，引物（10 μmol/L）各0.4 μL，ddH2O 8.2 μL。目的基因的相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCT法計(jì)算。

1.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，試驗(yàn)結(jié)果用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05為差異顯著；用Sigmia Plot軟件作柱狀圖。

2結(jié)果與分析

2.1總RNA的檢測(cè)結(jié)果endprint

經(jīng)紫外分光光度儀測(cè)定，各個(gè)樣本總RNA的純度（D260 nm/D230 nm）均為2.06～2.15，[JP2]瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，可見28S、18S、5S等3條條帶。這說明所提取的總RNA純度和完整性均符合反轉(zhuǎn)錄的要求，可以進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)。

2.2基因的PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果

由圖2可以看出，目的基因與持家基因條帶均在恰當(dāng)位置，后經(jīng)測(cè)序證實(shí)這2條條帶即為目的基因與持家基因。

2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

藏豬、長(zhǎng)白豬胃底組織目的基因Ghrelin及持家基因 β-actin cDNA擴(kuò)增曲線、熔解峰如圖3所示，熔解曲線為單一的峰，說明沒有非特異擴(kuò)增。

[FK（W13][TPRZL3.tif；S+2mm]

Ghrelin相對(duì)表達(dá)量如圖4所示，藏豬胃底組織中mRNA的表達(dá)量（0.495 8±0.023 1）顯著低于長(zhǎng)白豬（0.741 7±0.026 6）?？梢?，Ghrelin基因在藏豬胃底組織中mRNA的低表達(dá)可能是藏豬生長(zhǎng)緩慢的原因之一，這將為提高藏豬生長(zhǎng)速度的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

3結(jié)論與討論

Du等的研究結(jié)果表明，在仔豬斷奶后，其胃底Ghrelin mRNA表達(dá)量上調(diào)10 d[10]。在體外，半胱胺能顯著增加胃黏膜細(xì)胞Ghrelin mRNA的表達(dá)[11]。Yang等的研究表明，高銅日糧可以通過增強(qiáng)生長(zhǎng)豬Ghrelin mRNA的表達(dá)水平、生長(zhǎng)激素（growth hormone）的分泌來提高采食量、促進(jìn)體質(zhì)量的增加[12]；Yin等也有類似的結(jié)果，認(rèn)為仔豬日糧中添加ZnO能刺激其胃中Ghrelin的分泌[13]。而禁食24、48 h均能顯著降低大鼠下丘腦中Ghrelin mRNA的表達(dá)水平[14]。在禁食72 h后，斷奶仔豬下丘腦、垂體、胃中Ghrelin mRNA的表達(dá)水平均

較低[15]。在豬、羊等動(dòng)物上已證實(shí)，動(dòng)物攝食可以促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)[7-8]，本研究結(jié)果與之基本一致，即Ghrelin基因在藏豬胃底組織中mRNA的表達(dá)顯著低于長(zhǎng)白豬，這可能是藏豬生長(zhǎng)緩慢的原因之一。然而李加龍卻得出相反的研究結(jié)果，在牦牛皺胃中，Ghrelin陽(yáng)性細(xì)胞分布于黏膜層胃底腺的下部，而瘤胃、網(wǎng)胃和瓣胃上未見其表達(dá)，牦牛Ghrelin陽(yáng)性產(chǎn)物的表達(dá)面積（S）和累計(jì)光密度值（IOD）均大于黃牛且差異極顯著（P<0.01），他認(rèn)為牦牛胃中的Ghrelin可能以內(nèi)源性為主，且與外源性相結(jié)合共同參與了食欲、攝食行為及能量代謝與平衡等生理功能的調(diào)節(jié)[16]。這可能與物種等不同有關(guān)，若究其原因，尚需進(jìn)一步研究。

總之，Ghrelin具有調(diào)節(jié)生長(zhǎng)激素分泌、攝食等多種生物學(xué)作用，而動(dòng)物攝食可以促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。藏豬胃底組織中Ghrelin mRNA的表達(dá)量顯著低于長(zhǎng)白豬，即該基因在藏豬胃底組織中mRNA的低表達(dá)可能是藏豬生長(zhǎng)緩慢的原因之一，這將為提高藏豬生長(zhǎng)速度的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

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