李丹青，李淮玉，李靜，張梅

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，安徽合肥 230001；2.淮南市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，安徽淮南 232000）

隨著我國(guó)逐漸邁入老齡化社會(huì)，糖尿病、高血脂、高血壓等基礎(chǔ)疾病的發(fā)病率逐漸提高，與此相關(guān)的腦血管疾病更上升為第一位死亡和致殘的疾病，成為危害中老年人健康和生活質(zhì)量的常見病和多發(fā)病。其中缺血性卒中尤其是大動(dòng)脈粥樣硬化性缺血性卒中在臨床實(shí)踐中更是極為常見。

有研究表明，動(dòng)脈粥樣硬化所造成的腦血管狹窄以及斑塊的形成和不穩(wěn)定性是缺血性腦卒中尤其是大動(dòng)脈粥樣硬化性缺血性卒中發(fā)生的根本原因，且斑塊的不穩(wěn)定性相較于血管狹窄可能更為危險(xiǎn)［1］。

既往對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的研究，多集中在動(dòng)脈粥樣硬化過程中的慢性炎癥方面，尤其是促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊形成及發(fā)展的炎性因子及抗炎因子，而很少涉及到細(xì)胞老化方面。而眾所周知，動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)環(huán)節(jié)恰恰是血管內(nèi)皮細(xì)胞的老化及功能障礙。研究發(fā)現(xiàn)：端?？梢员徽J(rèn)為是細(xì)胞衰老的生物鐘。端粒越短，表明細(xì)胞分裂能力越差，剩余的分裂次數(shù)越少；端粒越長(zhǎng)，則表明細(xì)胞分裂能力強(qiáng)，剩余的分裂次數(shù)多。端粒的縮短參與細(xì)胞的衰老。發(fā)生在血管中，端粒的損耗可能會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞以及平滑肌細(xì)胞衰老和功能障礙，進(jìn)而參與動(dòng)脈粥樣硬化（AS）的病理演進(jìn)［2-6］，最終引發(fā)相應(yīng)的心腦血管疾病。

外周血白細(xì)胞端粒長(zhǎng)度（LTL）與腦卒中的相關(guān)研究尚不多且結(jié)果并非完全一致，與大動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的研究則更少。此外，LTL與缺血性卒中發(fā)生密切相關(guān)的斑塊的穩(wěn)定性研究國(guó)內(nèi)外則更難以找到。因此，本文旨在研究LTL與大動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年12月—2016年9月入住安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科的急性前循環(huán)梗腦死患者（年齡40～86歲）70例作為觀察組，以及與之年齡、性別匹配的來自安徽省立醫(yī)院檢中心的健康體檢者68例（年齡47～90歲）作為對(duì)照組。根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)，神經(jīng)系統(tǒng)查體、影像學(xué)檢查，由神經(jīng)內(nèi)科兩位主治以上職稱醫(yī)師確診。所有患者均根據(jù)2010年中國(guó)急性缺血性卒中診治指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)確診［7］。排除系統(tǒng)性疾病（如膠原性疾病、炎癥、肝臟或腎臟疾病、代謝性疾病等），排除心源性卒中、其他原因引起的缺血性腦卒中，如血管壁炎癥：結(jié)核性、梅毒性、化膿性、鉤端螺旋體感染、結(jié)締組織病、變態(tài)反應(yīng)性動(dòng)脈炎等；夾層動(dòng)脈瘤、脫水、全身感染、先天性血管畸形、真性紅細(xì)胞增多癥、高凝狀態(tài)、吸毒等繼發(fā)的缺血性腦卒中以及原因不明性的腦卒中。記錄研究對(duì)象的基線臨床資料包括年齡、性別、血脂、血糖、尿酸、吸煙史、飲酒史、糖尿病史、高血壓史、冠心病史等。同時(shí)，記錄觀察組的頸動(dòng)脈超聲檢查結(jié)果。實(shí)驗(yàn)排除14例研究對(duì)象，其中包括質(zhì)量不好的DNA以及加樣不好的DNA。最終納入70例前循環(huán)大動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死患者作為觀察組，以及68例健康體檢者作為對(duì)照組，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)其外周血白細(xì)胞相對(duì)端粒長(zhǎng)度。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 檢測(cè)端粒長(zhǎng)度［8-9］所有對(duì)象均于入組次晨空腹抽取靜脈血2 mL－20℃保存以用來提取外周血白細(xì)胞DNA，外周血細(xì)胞DNA提取試劑盒購(gòu)自于北京康為世紀(jì)公司，操作步驟嚴(yán)格按照操作說明書來進(jìn)行。DNA提取完成后，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度和純度，若樣品OD260／OD280在1.7～1.9之間，表明DNA純度符合要求，然后稀釋DNA樣本至100 mg·L－1以下。若未達(dá)到上述要求，說明提取的DNA不純，予以舍棄或重新提取DNA，直至符合要求。經(jīng)過上述過程，最終所有樣本的DNA濃度和純度均能達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。然后使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行外周血白細(xì)胞端粒的檢測(cè)。

原理：相對(duì)端粒長(zhǎng)度可以通過使用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)外周血白細(xì)胞端粒重復(fù)拷貝數(shù)（T）和單拷貝基因-globin的拷貝數(shù)（S），用端粒重復(fù)拷貝數(shù)T和-globin基因拷貝數(shù)的比值T／S表示。實(shí)時(shí)熒光定量PCR中，Ct值表示每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定域值時(shí)的循環(huán)數(shù)。相對(duì)端粒長(zhǎng)度（T／S）＝2－［Ct（telomere）－Ct（β－globin）樣品］／2－［Ct（telomere）－Ct（β－globin）標(biāo)準(zhǔn)品］。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀測(cè)量相對(duì)端粒長(zhǎng)度時(shí)，采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法。提取培養(yǎng)的HEK293S細(xì)胞DNA作為標(biāo)準(zhǔn)品以設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)曲線。其稀釋梯度如下：293標(biāo)準(zhǔn)品 100μg·L－1→梯度 200，100，50，25，12.5，6.25，3.125μg·L－1。

其反應(yīng)體系為20μL，采用SYBR＠Green。

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，其引物序列如下：

Telomere-F：5′CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT 3′

Telomere-R：5′GGCTTGCCgTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT3′

β-globin-F：5′GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC3′

β-globin-R：5′CACCA ACTTCATCCACGTTCACC3′

反應(yīng)條件：Telomere：95℃，15 s；54.3℃，60 s。

Globin：95℃，15 s；56℃，60 s。

1.2.2 頸動(dòng)脈血管超聲檢查 對(duì)每一位入組患者，使用多普勒超聲診斷儀進(jìn)行頸動(dòng)脈血管超聲檢查，檢查前調(diào)整探頭頻率在7.5～10 MHz之間。檢查時(shí)囑患者取仰臥位并充分放松，幫助患者頭部轉(zhuǎn)向檢查者的對(duì)側(cè)以充分暴露頭頸部，這樣更有利于檢查。然后將超聲探頭放置于被檢查者胸鎖乳突肌的前緣或后緣，從一側(cè)頸動(dòng)脈的起始處采用橫向和縱向的方式依次探查，檢查完畢后再使用相同的方法檢查另一側(cè)。斑塊形成定義為頸動(dòng)脈局部IMT≥1.2 mm或者≥臨近中間內(nèi)中膜厚度的1.5倍。根劇頸動(dòng)脈超聲斑塊的回聲特點(diǎn)，將斑塊分為穩(wěn)定性斑塊和不穩(wěn)定性斑塊。若回聲較高或不均質(zhì)，則提示斑塊較穩(wěn)定，若回聲較低或出現(xiàn)不規(guī)則無回聲區(qū)，則提示斑塊不穩(wěn)定，如脂質(zhì)型軟斑塊、混合型斑塊等。通過斑塊內(nèi)部回聲特點(diǎn)，將70例患者分為不穩(wěn)定頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊組和穩(wěn)定頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。當(dāng)P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。首先采用Kolmogorov-Smirnov正態(tài)分布檢驗(yàn)法對(duì)所有計(jì)量資料進(jìn)行變量分布的檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的資料用x±s表示。然后進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，如果方差齊，兩組間差異比較用 t檢驗(yàn)；若方差不齊，兩組間差異比較采用t′檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料，如本文中的三酰甘油，使用中位數(shù)、四分位數(shù)間距表示，組間比較采用Mann-Whitney秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)（百分比）表示，兩組間差異的比較采用χ2檢驗(yàn)。其中，白細(xì)胞端粒長(zhǎng)度在統(tǒng)計(jì)學(xué)分析之前，首先要進(jìn)行相應(yīng)的數(shù)據(jù)處理，即取T／S值的自然對(duì)數(shù)用于統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 結(jié)果

2.1 基線資料比較 本次研究共納入研究對(duì)象138例，其中觀察組大動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死患者70例，對(duì)照組健康體檢者68例。觀察組男45例，女25例，年齡40～86歲，平均年齡65.39歲。對(duì)照組男40例，女28例，年齡47～90歲，平均年齡62.22歲。性別分布采用χ2檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。年齡符合正態(tài)分布采用t檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。故觀察組及對(duì)照組性別年齡相匹配，具有可比性。其他血管危險(xiǎn)因素，觀察組和對(duì)照組在性別、年齡、三酰甘油、尿酸間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），然而在總膽固醇及高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL），高血壓病史、糖尿病病史、吸煙史及飲酒史中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這與既往的研究大致相符合，體現(xiàn)了上述因素為血管危險(xiǎn)因素。

2.2 觀察組與對(duì)照組間端粒長(zhǎng)度的比較 觀察組外周血端粒長(zhǎng)度1.31（0.88～1.94），對(duì)照組LTL 1.84（1.06～2.63），取相對(duì)端粒長(zhǎng)度的自然對(duì)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Kolmogorov-Smirnov正態(tài)分布檢驗(yàn)法檢驗(yàn)變量的分步，不符合正態(tài)分布，組間比較采用用非參數(shù)檢驗(yàn)中的Mann-Whitney秩和檢驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn) Mann-Whitney（Z）＝－3.158，P＝0.002，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明端?？s短與大動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死可能具有一定的相關(guān)性。但并不能排除其他危險(xiǎn)因素可能造成的差異。下面進(jìn)一步分析，端粒長(zhǎng)度與頸動(dòng)脈斑塊的關(guān)系。

2.3 穩(wěn)定斑塊組與不穩(wěn)定斑塊組間端粒長(zhǎng)度的比較 觀察組按照頸動(dòng)脈彩超的檢測(cè)結(jié)果分為不穩(wěn)定斑塊組（40例）以及穩(wěn)定斑塊組（30例）。不穩(wěn)定斑塊組端粒長(zhǎng)度（1.48±0.78），明顯短于穩(wěn)定斑塊組（1.72±0.49）。Kolmogorov-Smirnov正態(tài)分布檢驗(yàn)法檢驗(yàn)變量的分步，符合正態(tài)分布，不符合方差齊性，故組間比較采用近似 t檢驗(yàn)，結(jié)果 t′＝－3.750，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這說明端粒縮短可能與斑塊的形成及不穩(wěn)定性相關(guān)。

3 討論

端粒是位于真核細(xì)胞染色體末端的線性DNA蛋白質(zhì)復(fù)合體。其由短串聯(lián)重復(fù)序列TTAGGG及端粒結(jié)合蛋白構(gòu)成。端粒的單鏈DNA3′端與端粒結(jié)合蛋白結(jié)合形成1個(gè)被稱為T環(huán)的端粒環(huán)。T環(huán)可以看做染色體的“帽”結(jié)構(gòu)，其可以隱藏染色體DNA末端，防止染色體 DNA末端被核酸酶降解［10］，從而起到保護(hù)作用。但是由于線性DNA復(fù)制時(shí)具有不完全特性，即每次細(xì)胞分裂端粒都可能會(huì)丟失一小部分序列（大約50～200 bp），因此，端粒會(huì)隨著細(xì)胞的不斷分裂會(huì)進(jìn)行性縮短。一定限度的縮短并不會(huì)影響細(xì)胞的基本生命活動(dòng)，但當(dāng)端?？s短到無法維持T環(huán)時(shí)，那么端粒就無法保護(hù)染色體的末端，染色體將失去穩(wěn)定性，發(fā)生畸變、斷裂或缺失，細(xì)胞將進(jìn)入衰老和死亡。因此端粒被稱為細(xì)胞衰老的生物鐘。端粒越短，細(xì)胞分裂能力越差，剩余的分裂次數(shù)越少；端粒越長(zhǎng)，細(xì)胞分裂能力強(qiáng)，剩余的分裂次數(shù)多。端粒的損耗可能會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞以及平滑肌細(xì)胞衰老和功能障礙，進(jìn)而參與動(dòng)脈粥樣硬化的病理演進(jìn)［2-6］，最終引發(fā)相應(yīng)的心腦血管疾病。

表1 觀察組和對(duì)照組血管危險(xiǎn)因素的比較

近年來對(duì)于LTL與卒中發(fā)生、發(fā)展相關(guān)性研究，尚不是很多且存在差異。Ding等［11］納入腦卒中患者及健康對(duì)照組各1 309例，比較其外周血端粒長(zhǎng)度，結(jié)果觀察組LTL比對(duì)照組顯著縮短，進(jìn)一步隨訪其中858例腦卒中患者5年，發(fā)現(xiàn)端粒長(zhǎng)度縮短可以預(yù)測(cè)卒中后的死亡風(fēng)險(xiǎn)。哈佛醫(yī)學(xué)院在護(hù)士健康研究中心和醫(yī)生健康研究中心進(jìn)行前瞻性的研究，采用巢式病例對(duì)照研究的方法［12］，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LTL與年齡成反比，觀察組與對(duì)照組端粒長(zhǎng)度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并未說明端粒長(zhǎng)度與腦卒中之間的聯(lián)系。一項(xiàng)來自歐洲的研究也未說明端粒長(zhǎng)度與腦卒中之間的聯(lián)系［13］。國(guó)內(nèi)相關(guān)研究尚不多，Zhang等［14］大樣本前瞻性病例對(duì)照研究，選取1 801名健康體檢者作為對(duì)照組、1 756例卒中患者作為觀察組（其中動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死767例，腔隙性腦梗死503例，腦出血486例），然后隨訪4.5年。通過回歸分析在校正危險(xiǎn)因素后，最終得出的結(jié)果是，動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死患者，端粒較短者發(fā)生全因死亡的風(fēng)險(xiǎn)增加69%，心腦血管死亡風(fēng)險(xiǎn)是長(zhǎng)端粒組的2.57倍。并未發(fā)現(xiàn)腔隙性腦梗死和腦出血端?？s短與全因死亡和心腦血管死亡風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。在此基礎(chǔ)上，李靜等［15］對(duì)外周血白細(xì)胞相對(duì)端粒長(zhǎng)度與腦卒中的相關(guān)性進(jìn)行了研究，他們進(jìn)行的是病例對(duì)照研究，納入了觀察組初發(fā)腦卒中患者543例（其中224例為動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死）和健康對(duì)照組616例作為對(duì)照組，RT-PCR檢測(cè)相對(duì)端粒長(zhǎng)度。通過多元Logistic回歸模型分析腦卒中與端粒長(zhǎng)度的關(guān)系，最終并未發(fā)現(xiàn)端粒長(zhǎng)度與腦卒中之間相關(guān)，在進(jìn)一步對(duì)卒中亞型的分析過程中，得出動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死組與對(duì)照組比較，端粒長(zhǎng)度顯著縮短。這與之前Zhang等［14］的研究是相符合的。Ding等［11］的病例對(duì)照研究，結(jié)果亦顯示腦卒中患者端粒長(zhǎng)度較對(duì)照組顯著縮短；動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死和腔隙性腦梗與對(duì)照組比較，端粒長(zhǎng)度顯著縮短；而腦出血與對(duì)照組比較端粒長(zhǎng)度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上這些研究提示，LTL并非是與各類型卒中均存在相關(guān)性，其主要與大動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死有關(guān)。本次研究結(jié)果也證明了端粒長(zhǎng)度與大動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死存在相關(guān)且LTL可能成為預(yù)測(cè)急性動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的生物指標(biāo)。猜測(cè)原因，端粒長(zhǎng)度的縮短可能是通過促進(jìn)動(dòng)脈粥樣的發(fā)生發(fā)展來促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的發(fā)生。

端粒與動(dòng)脈粥樣硬化的研究由來已久，源于Chang等［16］的研究，他們發(fā)現(xiàn)受到較大血管動(dòng)力應(yīng)力組的內(nèi)皮細(xì)胞端粒損耗率高于另一組。因此Chang等認(rèn)為端粒長(zhǎng)度可以用來反映動(dòng)脈粥樣硬化的演進(jìn)過程，而老化的血管細(xì)胞的可能在動(dòng)脈粥樣硬化中起了很大作用。在Chang研究的基礎(chǔ)上，Okuda等［17］通過比較腹主動(dòng)脈遠(yuǎn)端和近端內(nèi)皮細(xì)胞的DNA端粒長(zhǎng)度，發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)端腹主動(dòng)脈內(nèi)層和中層細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度與其動(dòng)脈粥樣硬化的程度成反比，進(jìn)一步支持了Chang等［16］的觀點(diǎn)。美國(guó)弗明漢心臟研究組報(bào)道，在肥胖男性個(gè)體中端?？s短是頸動(dòng)脈內(nèi)膜-中膜厚度（IMT）增厚的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子；一項(xiàng)對(duì)男性頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊和端粒長(zhǎng)度的研究［18-19］發(fā)現(xiàn)頸動(dòng)脈粥樣硬化越明顯，端粒長(zhǎng)度越短。Chen等［20］研究了美洲印第安人的短端粒長(zhǎng)度與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生及進(jìn)展的關(guān)系，該研究是前瞻性隊(duì)列研究，納入2 819個(gè)在基線時(shí)間段（2001—2003年）無心血管疾病的參與者，最終隨訪到2006—2009年（平均隨訪時(shí)間是5.5年），結(jié)果提示低端粒長(zhǎng)度與斑塊的發(fā)生及進(jìn)展相關(guān)。上述研究從流行病學(xué)角度說明了端粒長(zhǎng)度與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展相關(guān)，本次研究結(jié)果與此相符，表現(xiàn)為不穩(wěn)定斑塊組LTL低于穩(wěn)定斑塊組，結(jié)合大動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的病因及發(fā)病機(jī)制，猜測(cè)LTL促進(jìn)大動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的發(fā)生可能是通過影響斑塊的性質(zhì)，促進(jìn)斑塊破裂來實(shí)現(xiàn)的。

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