于海，劉清華，肖培倫，王健欣，張明，蔣吉英，李進(jìn)，于麗，于樹娜

（濰坊醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院a.人體解剖學(xué)教研室，b.組織胚胎學(xué)教研室，山東濰坊 261053）

肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，病死率極高。據(jù)統(tǒng)計(jì)調(diào)查顯示，每年大約有13萬人死于肝癌［1］。雖然肝癌的臨床治療已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但發(fā)病率和病死率仍然居高不下，因此，肝癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移等機(jī)制的研究一直備受關(guān)注。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，自噬活性的異常改變與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等密切相關(guān)［2-6］。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法，檢測Beclin1、LC3和雷帕霉素靶蛋白（mTOR）三種自噬基因在肝癌組織及正常肝組織中的表達(dá)，并結(jié)合各相關(guān)臨床病理指標(biāo)，探討B(tài)eclin1、LC3和mTOR的表達(dá)水平在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其相互之間的關(guān)系，從而為肝癌診療及判斷預(yù)后找到分子標(biāo)志物，制定合理、有效的治療方案，最終提高患者的生存率。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院和齊魯醫(yī)院2013年12月—2016年12月肝癌手術(shù)切除標(biāo)本56例，標(biāo)本均經(jīng)病理切片HE染色證實(shí)為肝癌，所有病例術(shù)前均未接受任何放化療、肝動脈栓塞及免疫治療。按Edmondson-steiner分級標(biāo)準(zhǔn)：I級8例，Ⅱ級14例，Ⅲ級24例，Ⅳ級10例；分別測量切除后的腫瘤直徑，其中≤5 cm者24例，＞5 cm者32例。收集肝癌標(biāo)本中，男性40例，女性16例；年齡34～80歲，平均62歲；乙肝表面抗原（HBSAg）陽性者38例，陰性表達(dá)者18例；甲胎蛋白AFP≥400μg·L－1者30例，＜400μg·L－1者26例；有膽管癌栓者11例。同時(shí)取癌旁5 cm外正常肝組織標(biāo)本40例作為對照組。

1.2 試劑與方法

1.2.1 主要試劑 兔抗人Beclin1多克隆抗體、兔抗人LC3多克隆抗體均購自 Abcam公司，兔抗人mTOR多克隆抗體、通用型免疫組化檢測試劑盒、檸檬酸鹽緩沖液、DAB顯色試劑盒均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 免疫組織化學(xué)法 所有實(shí)驗(yàn)標(biāo)本均經(jīng)4%甲醛固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，以5μm厚連續(xù)切片。免疫組化技術(shù)采取SP法，具體操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。以PBS液代替一抗作為陰性對照。

1.3 結(jié)果判定 采用雙盲法評估免疫組化染色切片，Beclin1、LC3和mTOR均以細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)染成淡黃色、棕黃色或棕褐色為陽性表達(dá)。三者均采用二級計(jì)分法，陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)：隨機(jī)任選5個(gè)高倍鏡視野（400×），然后根據(jù)每張切片的陽性細(xì)胞百分率計(jì)數(shù)，＜5%為0分，5%～＜25%為1分，25%～＜50%為2分，≥50%為3分。著色強(qiáng)度分類：無著色計(jì)0分，淡黃色為1分，黃或棕黃色為2分，褐或棕褐色為3分。兩者計(jì)分相乘≥4分為免疫組化陽性（＋），＜4分計(jì)為免疫組化陰性（－）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩變量之間的相關(guān)性分析采用Spearman等級分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Beclin1、LC3和mTOR蛋白在肝癌組織和正常肝組織中的表達(dá) Beclin1蛋白在肝癌組織中的陽性表達(dá)率為75%（42／56），在正常肝組織中的陽性表達(dá)率為25%（10／40），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

LC3蛋白在肝癌組織中的陽性表達(dá)率為70%（39／56），在正常肝組織中的陽性表達(dá)率為30%（12／40），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

mTOR蛋白在肝癌組織中的陽性表達(dá)率為50%（28／56），在正常肝組織中的陽性表達(dá)率為28%（11／40），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、圖1～3。

表1 Beclin1、LC3和mTOR在肝癌及正常肝組織中的表達(dá)／例（%）

圖1 Beclin1蛋白在肝癌組織和正常肝組織中的表達(dá)（×400）

圖2 LC3在肝癌組織和正常肝組織中的表達(dá)（×400）

圖3 mTOR在肝癌組織和正常肝組織中的表達(dá)（×400）

2.2 肝癌組織中Beclin1、LC3和mTOR蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性 Spearman等級分析結(jié)果顯示，在肝癌組織中Beclin1與LC3在肝癌中的表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0.643，P＜0.01），與mTOR表達(dá)之間無明顯相關(guān)性（r＝－0.167，P＞0.05），LC3與mTOR表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.386，P＜0.01）。

2.3 肝癌組織中Beclin1、LC3和mTOR蛋白表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系 Beclin1、LC3和mTOR的表達(dá)均與年齡、性別、腫瘤大小、HBSAg、AFP值等均無顯著相關(guān)性（P＞0.05），但與病理學(xué)分級和有無膽管癌栓有關(guān)（P＜0.05）。見表2。

表2 Beclin1、LC3和mTOR在肝癌組織中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系／例（%）

3 討論

肝癌是臨床上最常見的惡性消化道腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率己上升為我國惡性腫瘤的第2位，其嚴(yán)重威脅著人類的健康生活。近年來，臨床上對于肝癌的治療方法有很多，例如：手術(shù)切除、介入治療及放、化療等，但其治療效果均欠佳，總體5年生存率不超過5%。分析其原因?yàn)椋河捎谄鋹盒猿潭雀?，早期癥狀不明顯，病情進(jìn)展速度快，大多數(shù)患者被發(fā)現(xiàn)時(shí)，已發(fā)生遠(yuǎn)處侵襲和轉(zhuǎn)移［7］。因此，通過對肝癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等相關(guān)機(jī)制的研究，顯得尤為迫切。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，自噬基因調(diào)控機(jī)制失調(diào)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)［2］。

至今為止，Beclin1作為唯一被發(fā)現(xiàn)的哺乳動物參與自噬的特異性基因［8］，該基因位于人類染色體17q21上，大約有150 kb，編碼一個(gè)2 098 bp的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。有研究顯示［9］，在前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤中，Beclin1基因存在缺失性的突變。張創(chuàng)杰［10］研究發(fā)現(xiàn)，Beclin1在胰腺癌中的表達(dá)低于正常胰腺組織。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Beclin1蛋白在肝癌組織（75%，42／56）中的陽性表達(dá)率高于正常肝組織（25%，10／40），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。分析其Beclin1在肝癌中高表達(dá)的原因，可能是由于肝癌生長迅速，腫瘤細(xì)胞需要自噬，以適應(yīng)營養(yǎng)缺乏和低氧的環(huán)境。

LC3作為參與自噬發(fā)生的關(guān)鍵基因，其表達(dá)水平與自噬活性關(guān)系密切，是監(jiān)測自噬的特異性標(biāo)志物［11］。LC3包括 LC3-Ⅰ和 LC3-Ⅱ，其中 LC3-Ⅱ可通過活化Atg12，結(jié)合Atg5，從而參與形成自噬體。有研究表明，LC3的異常表達(dá)與許多惡性腫瘤（例如：胃癌、大腸癌、宮頸癌等）的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后關(guān)系密切［12］。Huang等［13］報(bào)道了 LC3-Ⅱ在腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中表達(dá)降低，自噬活性下降。但是本研究結(jié)果顯示，LC3蛋白在肝癌組織（70%，39／56）中的陽性表達(dá)率高于正常肝組織（30%，12／40），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。上述結(jié)果說明，LC3的表達(dá)及作用在不同類型腫瘤中是各不相同的，其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用及其分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

哺乳動物mTOR作為PI3K／AKT信號傳導(dǎo)通路下游的效應(yīng)靶蛋白，在其信號的傳導(dǎo)過程中扮演著重要的角色。當(dāng)mTOR的活性被抑制時(shí)，可阻斷其下游S6K1信號傳導(dǎo)通路，使細(xì)胞由G1向S轉(zhuǎn)變所需的相關(guān)蛋白缺乏，細(xì)胞周期阻滯于G1期，進(jìn)而達(dá)到影響細(xì)胞周期的進(jìn)展，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用。張利等［14］研究發(fā)現(xiàn)，mTOR在結(jié)腸癌組織中的陽性表達(dá)率為78.5%，而在正常結(jié)腸組織中的陽性表達(dá)率為12%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。本研究結(jié)果顯示，mTOR蛋白在肝癌組織（50%，28／56）中的陽性表達(dá)率也高于正常肝組織（28%，11／40），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這說明mTOR的過度表達(dá)與激活可能與肝癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。

經(jīng)Spearman相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)結(jié)果顯示，在肝癌組織中Beclin1與LC3在肝癌中表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0.643，P＜0.01），與mTOR表達(dá)之間無明顯相關(guān)性（r＝－0.167，P＞0.05），LC3與 mTOR表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.386，P＜0.01）。這說明，三者在肝癌發(fā)生發(fā)展中的關(guān)系密切，Beclin1的高表達(dá)可以增強(qiáng)肝癌自噬活性，mTOR的高表達(dá)則會抑制肝癌自噬發(fā)生，兩者可能是通過不同PI3K（包括：Ⅰ型和Ⅲ型）信號傳導(dǎo)通路，分別發(fā)揮其自噬調(diào)控作用：（1）Ⅲ型PI3K復(fù)合物Vps15激酶通過調(diào)節(jié)PI3K的活性后，Beclin1即可將各種Apg蛋白整合到PI3K中，形成復(fù)合體來促進(jìn)自噬的發(fā)生；（2）而mTOR接受其上游的Ⅰ型PI3K／AKT信號傳到通路調(diào)控后，可隨后磷酸化它的兩個(gè)下游分子，即翻譯抑制分子eIF-4E結(jié)合蛋白 1（4E-BP1）和核糖體蛋白 S6激酶 1（S6K1）［15］，進(jìn)而來調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長、增殖，抑制自噬活性。本實(shí)驗(yàn)組56例肝癌組織中，Beclin1蛋白陽性表達(dá)者為42例，mTOR蛋白陽性表達(dá)者為28例，由此可見，Beclin1蛋白陽性表達(dá)者高于mTOR蛋白陽性表達(dá)者，所以我們推測Beclin1高表達(dá)所產(chǎn)生的促進(jìn)自噬作用明顯強(qiáng)于mTOR過表達(dá)產(chǎn)生的抑制自噬作用，因此，自噬活性標(biāo)志分子LC3蛋白表達(dá)水平均升高，即肝癌的自噬活性亦隨之增高。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)還證實(shí)，在肝癌組織中，Beclin1、LC3和mTOR的表達(dá)均與年齡、性別、腫瘤大小、HBSAg、AFP值等均無顯著相關(guān)性（P＞0.05），但與病理學(xué)分級和有無膽管癌栓有關(guān)（P＜0.05）。

總之，Beclin1、LC3和mTOR蛋白在肝癌自噬活性調(diào)控中，發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，因此聯(lián)合檢測三者的蛋白表達(dá)水平，可以更加客觀的評估肝癌患者的預(yù)后，從而為肝癌診療及判斷預(yù)后找到分子標(biāo)志物，制定合理、有效的治療方案，最終提高患者的生存率。

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