高玉霞，董學(xué)彩，王文翔，盛修貴

（1.新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院婦科，河南 新鄉(xiāng) 453000；2.山東省腫瘤醫(yī)院婦科，山東濟(jì)南 250100）

不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)是指在排除染色體、解剖、感染、免疫、內(nèi)分泌等因素后，育齡期婦女與同一性伴侶連續(xù)發(fā)生自然流產(chǎn)超過2次，約占復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的40%～80%［1］，該病發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，涉及多因素、多步驟，目前尚未研究清楚。研究表明［2］，絨毛血管增生、滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、侵襲對正常妊娠至關(guān)重要，妊娠早期胚胎發(fā)育在相對乏氧環(huán)境中進(jìn)行，乏氧可對滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲及絨毛血管生成進(jìn)行調(diào)節(jié)。因此，乏氧可能在不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)中發(fā)揮重要作用。微小RNA（miRNA）作為一種短小單鏈非編碼RNA，在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、組織和器官發(fā)育、血管生成等多種生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用［3］，miRNA-223-3p作為 miRNA重要類型之一，P70核蛋白體激酶（Rps6kb1）可能是其潛在靶基因或直接作用基因［4］，而Rps6kb1亦是mTOR信號通路下游重要的傳遞分子［5］，研究表明［6］，mTOR信號通路在調(diào)控缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）表達(dá)中發(fā)揮重要作用。HIF-1α是調(diào)控缺氧環(huán)境下血管新生中發(fā)揮關(guān)鍵性作用［7］。本研究擬對不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛組織中miRNA-223-3p表達(dá)進(jìn)行檢測，分析其對Rps6kb1／HIF-1α信號通路的影響，以期為發(fā)生不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)生的可能機(jī)制提供線索。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年5月—2015年6月在新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者57例，年齡23～34歲，平均年齡（27.6±4.2）歲，孕齡51～69 d，臨床表現(xiàn)陰道出血或腹痛，B超提示無原始心管搏動，臨床確診為難免流產(chǎn)，排除解剖結(jié)構(gòu)異常、染色體異常、感染、免疫、內(nèi)分泌等原因引起的流產(chǎn)，均連續(xù)出現(xiàn)自然流2次及以上，其中，2～3次36例，≥4次21例。同期，選取正常早孕行人工流產(chǎn)術(shù)患者42例作為對照組，年齡24～36歲，平均年齡（28.2±4.5）歲，孕齡48～63 d，B超檢查及血絨毛膜促性腺激素檢查均正常，無先兆流產(chǎn)癥狀，均排除解剖結(jié)構(gòu)異常、染色體異常、感染、免疫、內(nèi)分泌等疾病。所有患者行清宮術(shù)后留取絨毛組織，每份標(biāo)本分成2份，1份用生理鹽水沖洗后保存于－70℃冰箱中以備檢，另1份用甲醛固定后，脫水、包埋、切片，保存于4℃條件下。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均行知情同意。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑和設(shè)備 TRIzol總RNA提取試劑盒由寶生物工程（大連）有限公司提供，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒均由天根生化科技（北京）有限公司提供，miRNA-223-3p、Rps6kb1、HIF-1α、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及內(nèi)參引物序列均由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)合成，鼠抗人血管內(nèi)皮細(xì)胞CD34單克隆抗體、HRP標(biāo)記山羊抗鼠二抗和免疫組化SP法染色試劑盒由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供，紫外分光光度計(jì)購自上海譜元儀器有限公司，實(shí)時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.2.2 利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測絨毛組織中 miRNA-223-3p、Rps6kb1、HIF-1α和 VEGF表達(dá)取絨毛組織，研磨后加入細(xì)胞裂解液裂解，用TRIzol總RNA提取試劑盒對總mRNA進(jìn)行提取，并用紫外分光光度計(jì)檢測純度，以A260／A280≥1.80作為合格樣品。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總mRNA逆轉(zhuǎn)錄為單鏈模板鏈cDNA，以cDNA為模板用PCR反應(yīng)試劑盒進(jìn)行 PCR，引物序列見表 1。PCR反應(yīng)條件：94℃ 60 s，94℃ 45 s，56℃ 45 s，74℃ 30 s，連續(xù)進(jìn)行38個循環(huán)，以內(nèi)參為對照，用2－△△Ct法獲得絨毛組織中 miRNA-223-3p、Rps6kb1、HIF-1α和 VEGF表達(dá)量。

表1 引物序列

1.2.3 免疫組化法檢測絨毛組織中微血管密度（MVD） 取絨毛組織切片，脫蠟、水化后，進(jìn)行抗原修復(fù)，加入3%H2O2以使內(nèi)源性過氧化物沒失活。將鼠抗人血管內(nèi)皮細(xì)胞CD34單克隆抗體（1∶500稀釋）加入，4℃下過夜孵育，以PBS代替一抗作為陰性對照，將HRP標(biāo)記山羊抗鼠二抗（1∶800）加入，37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，DAB顯色30 min，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片，于高倍鏡下觀察。微血管陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：血管內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞簇出現(xiàn)棕黃色染色，管腔由8個以上紅細(xì)胞組成，有肌層的不計(jì)在內(nèi)。每個切片均取5個視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，取均值作為MVD。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。觀測資料主要為正態(tài)計(jì)量資料，采用x±s表示，組間比較采用單因素方差分析或t檢驗(yàn)。此外利用Pearson相關(guān)分析對變量間相關(guān)關(guān)系進(jìn)行分析。P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者絨毛組織中 miRNA-223-3p、Rps6kb1、HIF-1α和VEGF表達(dá)比較 不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛組織中miRNA-223-3p表達(dá)量高于對照組，而 Rps6kb1 mRNA、HIF-1αmRNA和VEGF mRNA表達(dá)量均低于對照組，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝17.058、11.947、10.477和 13.383，P＜0.05）；≥4次不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者miRNA-223-3p表達(dá)量高于2～3次和對照組，而Rps6kb1 mRNA、HIF-1αmRNA和VEGF mRNA表達(dá)量低于2～3次和對照組，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

2.2 兩組患者絨毛組織中MVD比較 免疫組化結(jié)果顯示，不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛組織中血管發(fā)育不良，血管數(shù)量減少，管腔變小或消失，見圖1。不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛組織中MVD為（23.3±6.1）個，遠(yuǎn)低于對照組的（41.6±5.3）個，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝15.476，P＜0.001），≥4次不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛組織中MVD為（18.5±3.7），低于2～3次的（26.8±4.1），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝7.034，P＜0.001）。

2.3 不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛組織中miRNA-223-3p表達(dá)量與HIF-1α和VEGF表達(dá)量及MVD相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析顯示，不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛組織中miRNA-223-3p表達(dá)量與HIF-1αmRNA和VEGF mRNA表達(dá)量及MVD均呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.496、－0.638和 －0.597，P＜0.001）；HIF-1αmRNA表達(dá)量與VEGF mRNA表達(dá)量和MVD均呈正相關(guān)（r＝0.584和0.439，P＜0.001）；VEGF mRNA表達(dá)量與MVD呈正相關(guān)（r＝0.600，P＜0.001）。

3 討論

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)作為婦產(chǎn)科常見的疾病，發(fā)生率約為1%～5%，且隨著流產(chǎn)次數(shù)增加而再次發(fā)生的風(fēng)險隨之增加［8］，目前，大部分復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者不能找到明確原因，對于這部分患者主要采取注射免疫球蛋白、抗凝血等免疫治療手段，但仍有20%～30%患者無效［9］，提示不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者仍存在其他病因和機(jī)制。研究表明［10］，妊娠早期胚胎在相對缺氧的環(huán)境中進(jìn)行，局部氧分壓變化可通過調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力及絨毛血管生成而影響胚胎發(fā)育。HIF-1α作為受氧濃度調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子，是缺氧環(huán)境下誘導(dǎo)血管生成的關(guān)鍵性調(diào)控因子［11］，VEGF作為調(diào)控血管生成的中樞性物質(zhì)，可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞及滋養(yǎng)細(xì)胞增殖而加速血管生成［12］。有研究指出［13］，早孕期宮腔缺氧可誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)HIF-1α，HIF-1α可通過促使 VEGF等的表達(dá)而促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖及血管生成，以維持胚胎發(fā)育所需營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)。本研究顯示，不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛組織中HIF-1αmRNA和VEGF mRNA表達(dá)量均低于對照組，≥4次不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者HIF-1αmRNA和VEGF mRNA表達(dá)量低于2～3次和對照組，說明不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者早孕期絨毛組織中HIF-1α和VEGF表達(dá)量降低，且隨著流產(chǎn)次數(shù)增多這種抑制作用越強(qiáng)，提示不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)可能與絨毛組織中HIF-1α和VEGF表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

表2 兩組患者絨毛組織中miRNA-223-3p、Rps6kb1、HIF-1α和VEGF表達(dá)比較／x±s

圖1 兩組患者絨毛組織中MVD（SP法×400）

miRNA-223-3p定位于Xq12，可通過調(diào)控其靶基因而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡過程，與多種惡性腫瘤發(fā)生及侵襲、轉(zhuǎn)移過程有關(guān)［14］。研究表明［15］，miRNA-223-3p可作為抑癌基因而發(fā)揮作用，可通過調(diào)控Artemin、IGF-1R等靶點(diǎn)而抑制實(shí)體腫瘤的增殖及侵襲、轉(zhuǎn)移。亦有研究指出［16］，miRNA-223-3p可直接調(diào)控IGF-1R下游Akt／mTOR／Rps6kb1信號通路而調(diào)控細(xì)胞增殖。本研究顯示，不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛組織中miRNA-223-3p表達(dá)量高于對照組，≥4次不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者miRNA-223-3p表達(dá)量高于2～3次和對照組，說明miRNA-223-3p在不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛組織中表達(dá)上調(diào)，且與流產(chǎn)次數(shù)有關(guān)，提示miRNA-223-3p表達(dá)上調(diào)可能與不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)有關(guān)。本研究顯示，不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛組織中Rps6kb1 mRNA表達(dá)量均低于對照組，≥4次患者Rps6kb1 mRNA表達(dá)量低于2～3次和對照組，說明不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛組織中Rps6kb1信號分子被抑制，Pearson相關(guān)分析顯示，不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛組織中miRNA-223-3p表達(dá)量與HIF-1αmRNA和 VEGF mRNA表達(dá)量均呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.496、－0.638，P＜0.001），免疫組化結(jié)果亦顯示，不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛組織中MVD遠(yuǎn)低于對照組，提示不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛組織中高表達(dá)miRNA-223-3p可能通過抑制Rps6kb1／HIF-1α信號通路而使HIF-1α和VEGF表達(dá)降低，使絨毛組織對低氧環(huán)境耐受性降低，使血管生成數(shù)量減少，導(dǎo)致MVD降低，而使滋養(yǎng)層及胎盤血供不足，使早孕兒血循環(huán)障礙而導(dǎo)致流產(chǎn)發(fā)生。

綜上所述，miRNA-223-3p在不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛組織中表達(dá)上調(diào)，可能與Rps6kb1／HIF-1α信號通路有關(guān)。

［1］ ATA B，TAN SL，SHEHATA F，et al.A systematic review of intravenous immunoglobulin for treatment of unexplained recurrent miscarriage［J］.Fertil Steril，2011，95（3）：1080-1085.

［2］ C?L-MADENDAGI，MADENDAG Y，ALTINKAYA S?，et al.The role of VEGF and its receptors in the etiology of early pregnancy loss［J］.Gynecol Endocrinol，2014，30（2）：153-156.

［3］ CHEN L，ZHANG BY，F(xiàn)ENG GD，et al.The mechanism of miRNA-mediated PGR signaling pathway in regulating female reproduction［J］.Hereditas，2016，38（1）：40-51.

［4］ 戴國華，宋憲波，馬培澤，等.微小 RNA-223-3p通過調(diào)節(jié)Rps6kb1／HIF-1α信號通路抑制缺血心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞血管新生［J］.中華心血管病雜志，2014，42（12）：1039-1047.

［5］ 鄭宜文，王春梅，高學(xué)軍，等.奶牛乳腺組織RPS6KB1基因啟動子甲基化分析［J］.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2013，29（5）：469-474.

［6］ 何桂鈞，朱宏，施瑞華.雷帕霉素對食管癌細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子-1α和糖酵解途徑的影響［J］.腫瘤預(yù)防與治療，2013，26（4）：187-191，200.

［7］ MASOUD GN，LI W.HIF-1αpathway：role，regulation and intervention for cancer therapy［J］.Acta Pharm Sin B，2015，5（5）：378-389.

［8］ SESHADRI S，SUNKARA SK.Natural killer cells in female infertility and recurrent miscarriage：a systematic review and meta-analysis［J］.Hum Reprod Update，2014，20（3）：429-438.

［9］ 尹璐，金志春.復(fù)發(fā)性流產(chǎn)相關(guān)免疫因素及作用機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.中西醫(yī)結(jié)合研究，2015，7（3）：158-161.

［10］GRAZUL-BILSKA AT，JOHNSON ML，BOROWICZ PP，et al.Placental development during early pregnancy in sheep：effects of embryo origin on vascularization［J］.Reproduction，2014，147（5）：639-648.

［11］GUO Y，F(xiàn)ENG L，ZHOU Y，et al.Systematic review with meta-analysis：HIF-1αattenuates liver ischemia-reperfusion injury［J］.Transplant Rev（Orlando），2015，29（3）：127-134.

［12］CELLA CA，MINUCCI S，SPADA F，et al.Dual inhibition of mTOR pathway and VEGF signalling in neuroendocrine neoplasms：from bench to bedside［J］.Cancer Treat Rev，2015，41（9）：754-760.

［13］CINDROVA-DAVIES T，VAN PATOT MT，GARDNER L，et al.Energy status and HIF signalling in chorionic villi show no evidence of hypoxic stress during human early placental development［J］.Mol Hum Reprod，2015，21（3）：296-308.

［14］魯曉靜，江倩，黃鵬麗，等.直接RT-PCR擴(kuò)增法研究miR-223在兒童急性淋巴細(xì)胞白血病血漿中的異常表達(dá)［J］.中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2013，21（1）：68-72.

［15］HANEKLAUSM，GERLICM，O′NEILL LA，et al.miR-223：infection，inflammation and cancer［J］.J Intern Med，2013，274（3）：215-226.

［16］LI G，CAI M，F(xiàn)U D，et al.Heat shock protein 90B1 plays an oncogenic role and is a target of microRNA-223 in human osteosarcoma［J］.Cell Physiol Biochem，2012，30（6）：1481-1490.