展 翔

0 引言

研究表明，大約1/3的失血性休克(Hemorrhagic shock，HS)患者會(huì)發(fā)生急性腎損傷(Acute kidney injury，AKI)[1]。AKI會(huì)導(dǎo)致HS患者多器官衰竭發(fā)病率和死亡率增加[2]。腎臟組織對(duì)血液低灌注和缺氧非常敏感[3]。目前，已將抗炎和抗凝列為HS新的治療靶點(diǎn)。血管內(nèi)皮細(xì)胞廣泛參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)與凝血過程。近年來發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體(Endothelial protein C receptor，EPCR)是新型蛋白受體，是體內(nèi)蛋白激酶C系統(tǒng)的重要組成[4-5]。在血管內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷后，內(nèi)皮細(xì)胞釋放大量EPCR，增加了血漿中的可溶性EPCR。目前，血管內(nèi)皮細(xì)胞受損可采用血漿中可溶性EPCR的水平來體現(xiàn)與表征。

異甘草素(Isoliquiritigenin，ISO)作為異黃酮類化合物的一種，在豆科植物甘草的根、黃芪、滇黃精的根、豆芽、鷹嘴豆的幼苗、串果藤、香殊蘭的球莖等中大量存在[6-7]。異甘草素在抗病毒、抗炎、抗血管生成、催眠等方面具有較好的效果，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，其可以降低TNF-α等炎癥因子的表達(dá)，減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷[8-9]。本研究旨在通過失血性休克大鼠模型，以血清尿素氮和肌酐水平以及腎組織EPCR的表達(dá)水平為研究指標(biāo)，觀察HS前后的改變，初步探討HS早期AKI損傷的發(fā)生機(jī)制以及異甘草素的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 戊巴比妥鈉、林格液和異甘草素購自上海阿拉丁試劑有限公司，Trizol試劑盒購自美國Invitrogen公司，瓊脂糖凝膠購自美國Sigma公司，兔抗大鼠EPCR單克隆抗體、β-actin抗體和二抗購自美國R&D Systems公司；UniCel DxC 800型全自動(dòng)生化分析儀來源于美國Beckman Coulter公司，Gene Amp PCR System 2400型購自美國PE等。

1.2 動(dòng)物分組 成年SD大鼠75只，雄性，周齡7周左右，體重250～300 g，由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為5組：空白對(duì)照組(C組)、假手術(shù)組(S組)、失血性休克組(HS組)、林格液復(fù)蘇組(R組)和異甘草素復(fù)蘇組(I組)，每組15只。動(dòng)物房溫度維持在(25.0±0.5)℃，采用常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.3 失血性休克模型的建立 參考Umeda等[10]的方法。50 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射，待麻醉后將其仰臥并于鼠板上固定。C組：無其他操作，6 h后取外周血和腎組織。其余四組均進(jìn)行股動(dòng)靜脈插管。分離右側(cè)股動(dòng)脈，使用PowerLab 15T行動(dòng)脈插管，通過三通及壓力傳感器，動(dòng)脈插管與多功能監(jiān)護(hù)儀相連，對(duì)平均動(dòng)脈壓進(jìn)行監(jiān)測。經(jīng)股靜脈放血，液體復(fù)蘇。S組：動(dòng)靜脈插管后無其他操作，在6 h后對(duì)外周血和腎組織進(jìn)行取樣。HS組：在插管成功后15 min內(nèi)進(jìn)行放血，并使MAP降至35 mmHg，使其穩(wěn)定60 min，即為HS造模成功。6 h后取外周血和腎組織。林格液復(fù)蘇組：造模成功后，30 min內(nèi)輸注3倍失血量的林格液復(fù)蘇。于造模成功6 h后取外周血和腎組織。I組：異甘草素20 μg/mL，再輸入林格液補(bǔ)充至失血量3倍，所有液體在30 min內(nèi)輸完。于造模成功6 h后取外周血和腎組織。

1.4 反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) 應(yīng)用RT-PCR檢測腎組織EPCR mRNA的表達(dá)。參考上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司基因庫設(shè)計(jì)合成，EPCR引物系列：上游引物：5′-TCTACCTGTCCCAGTTCAA-3′；下游引物：5′-CATACCGAGTCCGATTGT-3′。β-actin引物系列：上游引物：5′-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3′；下游引物：5′-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3′。采用Trizol試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行提取。按Takara公司說明書步驟在Gene Amp PCR System 2400型嚴(yán)格操作反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR循環(huán)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，EPCR 53.3 ℃，β-actin 58 ℃，分別退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30～32個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后于72 ℃延伸5 min，-20 ℃保存?zhèn)溆?。? μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與1 μL 6×Loading buffer液相混勻后進(jìn)行瓊脂糖(1.5%)電泳，5 V/cm條件，灰度掃描采用Gel 3.0進(jìn)行分析。目的基因mRNA水平的相對(duì)指標(biāo)為目的基因與β-actin的PCR產(chǎn)物條帶的灰度之比。

1.5 Western blot檢測 腎臟組織經(jīng)過研磨、裂解后，通過酶標(biāo)儀測定蛋白濃度。上樣總蛋白質(zhì)量為80 μg，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離后，將蛋白質(zhì)通過電印跡轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)至PVDF膜，采用麗春紅S染色，并根據(jù)所需要的目標(biāo)條帶進(jìn)行剪膜，用含有脫脂奶粉(質(zhì)量濃度為5%)的TBS-T溶液在室溫下封閉2 h，分別加入兔抗大鼠EPCR單克隆抗體和β-actin抗體，于4 ℃下過夜孵育，在室溫下采用TBS-T溶液洗膜，隨后加入二抗進(jìn)行孵育2 h，用TBS-T溶液洗膜后與ECL試劑進(jìn)行反應(yīng)，膠片曝光，掃描膠片，用Image J軟件計(jì)算條帶光密度(OD)值，以EPCR與β-actin條帶的OD比值來評(píng)定蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。

1.6 病理損傷評(píng)分系統(tǒng) 腎小管受損采用以下?lián)p傷評(píng)分系統(tǒng)：0分：沒有腎小管上皮細(xì)胞凋亡、管腔擴(kuò)張或出血；1分：<5%的腎小管出現(xiàn)上皮細(xì)胞凋亡，管腔擴(kuò)張或出血；2分：5%～25%的腎小管出現(xiàn)上皮細(xì)胞凋亡，管腔擴(kuò)張或出血；3分：25%～75%的腎小管出現(xiàn)上皮細(xì)胞凋亡，管腔擴(kuò)張或出血；3分：>75%的腎小管出現(xiàn)上皮細(xì)胞凋亡，管腔擴(kuò)張或出血。

1.7 血清尿素氮和肌酐水平檢測 取大鼠外周血2 mL，3 000 r/min離心15 min，取上層血清，采用UniCel DxC 800型全自動(dòng)生化分析儀(Beckman Coulter，美國)測量血清尿素氮和肌酐水平。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腎組織EPCR mRNA水平比較 與C組比較，S組腎組織EPCR mRNA的表達(dá)有所增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與C組和S組比較，HS組腎組織EPCR mRNA的表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與HS組比較，R組腎組織EPCR mRNA的表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與HS組和R組比較，I組腎組織EPCR mRNA的表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<005)。見圖1。

圖1 大鼠腎組織EPCR mRNA水平比較

2.2 大鼠腎組織EPCR蛋白質(zhì)水平比較 與C組比較，EPCR蛋白質(zhì)腎組織的表達(dá)在S組稍有增加，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與C組和S組比較，HS組均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與HS組比較，林格液復(fù)蘇后表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；I組較HS組和R組的腎組織EPCR 蛋白質(zhì)表達(dá)亦明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 大鼠腎組織EPCR蛋白質(zhì)水平比較

2.3 大鼠血清尿素氮和肌酐水平比較 與C組比較，S組血清尿素氮和肌酐的水平提升，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與C組和S組比較，HS組均有明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與HS組比較，林格液復(fù)蘇后水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與HS組和R組比較，I組的血清尿素氮和肌酐的水平也顯著降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 大鼠血清尿素氮和肌酐水平比較

注：與HS組比較，*P<0.05；與R組比較，#P<0.05

2.4 大鼠腎臟組織損傷情況比較 HS組損傷評(píng)分明顯高于C組與S組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；林格液和異甘草素復(fù)蘇后，腎臟組織損傷明顯減輕，損傷評(píng)分明顯低于HS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 大鼠的腎組織損傷評(píng)分比較

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞廣泛參與機(jī)體的炎癥與凝血過程。在機(jī)體發(fā)生HS時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞大量表達(dá)各種免疫分子，如：Toll樣受體、補(bǔ)體受體及T淋巴細(xì)胞共刺激分子等。1994年，F(xiàn)ukudome等[11]首次根據(jù)基因克隆技術(shù)從內(nèi)皮細(xì)胞基因文庫中獲得了一種能夠編碼蛋白質(zhì)C結(jié)合位點(diǎn)的蛋白，即EPCR。EPCR分子結(jié)構(gòu)與主要組織相容性復(fù)合物Ⅰ型分子相似，因此是一種Ⅰ型跨膜蛋白。EPCR通過與蛋白質(zhì)C結(jié)合，可使蛋白質(zhì)C的活化效率提高5～20倍[12]。EPCR在機(jī)體內(nèi)以結(jié)合型和可溶型2種形式存在，結(jié)合型EPCR主要存在于大血管內(nèi)皮細(xì)胞的表面，可溶型EPCR(sEPCR)來自于結(jié)合型EPCR。當(dāng)內(nèi)毒素或凝血酶與大血管內(nèi)皮細(xì)胞接觸時(shí)，其通過蛋白酶介導(dǎo)結(jié)合型EPCR從血管內(nèi)皮細(xì)胞表面脫落，以sEPCR的形式進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)[13-14]。目前，有學(xué)者將血漿中sEPCR的水平作為反映血管內(nèi)皮細(xì)胞受損的生物標(biāo)志物[15]。

本研究結(jié)果表明,與C組比較，S組腎組織EPCR mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明創(chuàng)傷對(duì)腎臟組織EPCR的表達(dá)起到了誘導(dǎo)提升的作用，這可能與創(chuàng)傷導(dǎo)致的機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致腎小管血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷有關(guān)。但是，因本研究S組的創(chuàng)傷較輕微(僅僅暴露了左股動(dòng)靜脈)，其程度不足以導(dǎo)致腎組織EPCR mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)升高到有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的程度。HS組腎組織EPCR mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)顯著高于C組和S組，說明除創(chuàng)傷因素誘導(dǎo)腎小管血管內(nèi)皮細(xì)胞受損之外，短時(shí)間內(nèi)大量失血導(dǎo)致的休克參與誘導(dǎo)腎臟組織EPCR mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平的增加。這可能是體內(nèi)多種炎癥細(xì)胞因子共同作用的結(jié)果。經(jīng)液體復(fù)蘇后，R組和I組腎臟組織EPCR mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)顯著低于HS組，表明失血性休克前期經(jīng)過充足的液體復(fù)蘇，使血液得到了充分的補(bǔ)充，林格液和異甘草素都可以改善機(jī)體的微循環(huán)，以保護(hù)腎小管血管內(nèi)皮細(xì)胞。另外，I組的EPCR mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平更低，提示其抗凝和抗炎活性較高，與林格液比較，能夠更加有效地保護(hù)腎小管血管內(nèi)皮細(xì)胞。另外，與C組比較，S組大鼠腎組織血清尿素氮和肌酐水平增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明創(chuàng)傷在一定程度上影響腎臟功能。HS組明顯高于C組和S組，提示除創(chuàng)傷因素導(dǎo)致腎功能障礙外，因短時(shí)間內(nèi)大量失血導(dǎo)致腎臟缺氧和血流低灌注，嚴(yán)重影響了大鼠的腎功能。經(jīng)液體復(fù)蘇后，R組及I組大鼠血清尿素氮和肌酐水平明顯低于HS組，提示失血性休克早期經(jīng)過充分的液體復(fù)蘇，血液得到了補(bǔ)充，糾正了腎臟缺氧和血流低灌注，從一定程度上恢復(fù)了腎臟的正常功能。C組與S組的腎小管形態(tài)基本正常，HS組可見大量的腎小管上皮細(xì)胞損傷，損傷評(píng)分明顯高于C組與S組；經(jīng)過林格液和異甘草素復(fù)蘇后，腎臟組織損傷明顯減輕。從形態(tài)學(xué)的角度再次證實(shí)了異甘草素可以保護(hù)失血性休克大鼠的腎功能。

綜上所述，失血性休克大鼠血清尿素氮和肌酐水平及腎臟組織EPCR表達(dá)增加，與失血性休克時(shí)急性腎臟損傷有關(guān)。異甘草素可以抑制腎組織EPCR的表達(dá)，從而起到保護(hù)腎臟功能的作用。

[1] Angele MK,Schneider CP,Chaudry IH.Bench-to-bedside review:latest results in hemorrhagic shock[J].Crit Care,2008,12(4):218.

[2] Gomes E,Antunes R,Dias C,et al.Acute kidney injury in severe trauma assessed by RIFLE criteria:a common feature without implications on mortality[J].Scand J Trauma Resusc Emerg Med,2010,18:1.

[3] Bihorac A,Delano MJ,Schold JD,et al.Incidence,clinical predictors,genomics,and outcome of acute kidney injury among trauma patients[J].Ann Surg,2010,252(1):158-165.

[4] Mohan RLV,Esmon CT,Pendurthi UR.Endothelial cell protein C receptor:a multiliganded and multifunctional receptor[J].Blood,2014,124(10):1553-1562.

[5] Navarro S,Bonet E,Estellés A,et al.The endothelial cell protein C receptor:its role in thrombosis[J].Thromb Res,2011,128(5):410-416.

[6] Gong H,Zhang BK,Yan M,et al.A protective mechanism of licorice (Glycyrrhiza uralensis):isoliquiritigenin stimulates detoxification system via Nrf2 activation[J].J Ethnopharmacol,2015,162:134-139.

[7] Zhao Z,Park SM,Guan L,et al.Isoliquiritigenin attenuates oxidative hepatic damage induced by carbon tetrachloride with or without buthionine sulfoximine[J].Chem Biol Interact,2015,225:13-20.

[8] 任歡歡,韓吉春,盧寧,等.異甘草素對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J].石河子大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2016,34(3):343-348.

[9] 楊永明,荔志云.異甘草素對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠神經(jīng)保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志,2014,18(21):1-4.

[10]Umeda K,Takahashi T,Inoue K,et al.Prevention of hemorrhagic shock-induced intestinal tissue injury by glutamine via heme oxygenase-1 induction[J].Shock,2009,31(1):40-49.

[11]Fukudome K,Esmon CT.Identification,cloning,and regulation of a novel endothelial cell protein C/activated protein C receptor[J].J Biol Chem,1994,269(42):26486-26491.

[12]Pendurthi UR,Rao LV.Factor VIIa interaction with endothelial cells and endothelial cell protein C receptor[J].Thromb Res,2010,125(Suppl 1):S19-S22.

[13]Ruf W,Schaffner F.Role of the protein C receptor in cancer progression[J].Thromb Res,2014,133(Suppl 2):S85-S89.

[14]Bouwens EA,Stavenuiter F,Mosnier LO.Mechanisms of anticoagulant and cytoprotective actions of the protein C pathway[J].J Thromb Haemost,2013,11(Suppl 1):242-253.

[15]Sarig G,Meir A,Wollner M,et al.Soluble endothelial protein C receptor and coagulation parameters as prognostic factors in non-small cell lung carcinoma[J].J Thromb Haemost,2013,11(4):768-771.