陳水綿， 俞翀曌， 李恩靈， 朱昊明， 陸靖波， 鄭 冰

（上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院檢驗科，上海 200127）

自身抗體在自身免疫性疾?。╝utoimmune disease，AID）的診斷與鑒別診斷、病情監(jiān)測、療效觀察及發(fā)病機制研究等方面有重要作用?？购丝贵w（anti-nuclear antibody，ANA）是抗細胞內(nèi)所有抗原成分的自身抗體的總稱，以IgG型為主。隨著分子免疫學的發(fā)展，抗可提取核抗原（extractable nuclear antigen，ENA）的檢測也已應用于多種AID的診斷[1-2]。對AID的深入研究發(fā)現(xiàn)，一些AID如類風濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）等有一定的“潛伏期”[3]，在健康人群中也有一定的陽性率，故而對AID患者與健康人群進行區(qū)分對臨床診斷非常重要。本研究通過大樣本分析AID確診患者血清ANA、ENA、抗雙鏈DNA（ds-DNA）抗體等自身抗體水平，以探討ANA相關(guān)實驗室檢測結(jié)果對臨床的指導作用。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院2016年3—9月就診、符合美國風濕病學會及肝病學會診斷標準的SLE患者1 001例、RA患者408例、干燥綜合征（Sj?gren syndrome，SS）患者255例、炎癥性肌?。╥nflammatory myositis，IM）患者54例、原發(fā)性系統(tǒng)性硬皮?。╬rimary systemic sclerosis，PSS）患者40例、強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）患者36例、混合型結(jié)締組織病（mixed connective tissue disease，MCTD）患者17例、原發(fā)性膽汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）患者57例、自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）患者37例，共1 905例患者，設(shè)為AID組；4 433名健康體檢者來自上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院體檢中心，被檢測人群無現(xiàn)有臨床癥狀、無嚴重疾病史（如癌癥、傳染病、糖尿病等）、排除孕期婦女。AID組年齡（42.2±16.3）歲，男254例、女1 651例；健康體檢組年齡（48.3±11.0）歲，男2 444名、女1 989名。

1.2 方法

ANA采用INOVA間接免疫熒光法檢測試劑盒在Quanta lyser 240免疫分析系統(tǒng)（西班牙BIOKIT.S.A公司）及INOVA View全自動免疫熒光顯微鏡上檢測，滴度≥1∶40判為陽性。ENA采用免疫斑點法試劑盒（德國Euroimmun公司）在BlotOne免疫印跡儀（德國Euro公司）上檢測，包被的特異性抗體有抗Sm抗體、抗尿嘧啶1低分子量核糖核蛋白（uracil-1 low molecular weight ribonucleoprotein，U1RNP）抗體、抗SSARo60抗體、抗SSB抗體、抗Rib-P抗體、抗Scl-70抗體和抗Jo-1抗體。抗ds-DNA抗體（試劑盒由愛爾蘭Trinity Biotech Plc公司生產(chǎn)）與抗核小體（nucleosome，Nuc）抗體（試劑盒由德國Euroimmun公司生產(chǎn)）采用酶聯(lián)免疫法在Sprint XL儀器（德國Euroimmun公司）上檢測，臨界值分別為77.0 IU/mL和20 RU/mL，樣本吸光度（A）值/標準品A值≥1.0。樣本檢測嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0、GraphPad Prism 5.01軟件進行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布數(shù)據(jù)以x ±s表示，采用t檢驗分析。非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用中位數(shù)（四分位數(shù)）表示，用中位數(shù)檢驗進行分析。相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析，指標的診斷效能采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 AID組ANA陽性率及主要核型分析

AID組ANA陽性率為88.4%（1 684/1 905）。核型檢出以均質(zhì)型[37.8%（720/1 905）]、核顆粒型[32.9%（627/1 905）]、混合型[8.8%（168/1 905）]為主，其中混合型主要為核顆粒/胞漿顆粒[30.95%（52/168）]、均質(zhì)/胞漿顆粒[11.3%（19/168）]、核膜/胞漿顆?；旌蟍10.71%（18/168）]，前2種混合型可見于各種AID，核膜/胞漿顆粒多見于AIH、PBC。見表1。

表1 不同AID患者ANA核型分布 [例（%）]

2.2 AID患者的ANA滴度分布

AID患者ANA滴度（中位數(shù)）為1∶320，其中AS（1∶80）、RA（1∶160）、IM（1∶160）患者ANA滴度（中位數(shù)）≤1∶160，其余AID患者均以高滴度（≥1∶320）為主。ANA主要核型滴度（中位數(shù)）分別是均質(zhì)型1∶320、核顆粒型1∶640、混合型1∶320、胞漿顆粒型1∶320、著絲點型1∶320。見圖1、圖2。

圖1 不同AID患者ANA的滴度（中位數(shù)）

圖2 不同AID患者核型滴度分布

2.3 風濕類AID患者相關(guān)自身抗體檢出情況

1 811例確診風濕類AID患者血清各種自身抗體檢出率差異明顯，ENA譜中檢出率居前3位的依次為抗SSA-Ro60抗體（40.9%）、抗U1RNP抗體（19.2%）、抗SSB抗體（10.8%）。ANA、ENA譜陽性符合率為51.1%（926/1 811）。見表2。

表2 不同風濕類AID患者相關(guān)自身抗體的檢出情況 [例（%）]

2.4 SLE患者ANA滴度與抗ds-DNA抗體的相關(guān)性分析

1 001例確診SLE患者ANA滴度與抗ds-DNA抗體呈正相關(guān)（r=0.394，P＜0.01），抗ds-DNA抗體陽性率為45.25%（453/1 001）?？筪s-DNA抗體陽性、陰性組滴度（中位數(shù)）分別為1∶640和1∶320 （P=0.00）；按核型分類，僅核顆粒型、均質(zhì)型ANA滴度（中位數(shù)）差異有統(tǒng)計學意義（P=0.00）。見圖3。

圖3 抗ds-DNA抗體陰性、陽性的SLE患者ANA滴度的分布

2.5 小兒SLE與成人SLE自身抗體陽性率的差異

在1 001例SLE患者中成人898例（年齡17～88歲），小兒103例（年齡1～16歲）。成人SLE組與小兒SLE組ANA滴度（中位數(shù)）分別為1∶640和1∶320 （P=0.00）。見圖4。2組間女性占比及ANA、抗U1RNP抗體、抗ds-DNA抗體、抗Nuc抗體陽性率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

圖4 成人SLE與小兒SLE患者ANA滴度的分布

表3 小兒SLE與成人SLE患者自身抗體水平的比較 [例（%）]

2.6 健康體檢者ANA核型與滴度分析

4 433名健康體檢者ANA陽性率為12.8%（568/4 433），主要核型為均質(zhì)型[42.8%（243/568）]、核顆粒型[37.2%（211/568）]、核仁型[6.9%（39/568）]，滴度（中位數(shù)）為1∶80。高滴度組（≥1∶320，0.9%）和低滴度組（1∶40～1∶160，99.1%）女性占比分別為76.3%和44.6%（P=0.001）。

AID組和健康體檢組ANA滴度（中位數(shù)）分別為1∶320、1∶80（P=0.000），對2組的ANA滴度進行ROC曲線分析，當?shù)味确謩e為1∶80、1∶160時，ANA的敏感性分別為97.1%和80.1%，特異性分別為38.7%和80.8%。見圖5。

圖5 AID組與健康體檢組ANA滴度的ROC曲線

3 討論

自身抗體是診斷AID的重要依據(jù)，每種AID都伴有特征性的自身抗體譜。以往報道的結(jié)果多為小樣本研究，且各學者報道也存在較大的差異。本研究通過大樣本分析了不同自身抗體在不同AID中的差異及健康人群ANA的檢出情況，結(jié)果顯示AID組ANA陽性率為88.4%，與文獻報道[4]基本一致，其中均質(zhì)型在SLE、RA、PSS及核顆粒型在SS、MCTD中的陽性率高于其他核型，這與各疾病特異性靶抗原的抗ds-DNA/Nuc、抗SSA/SSB、抗U1RNP等抗體在Hep-2細胞內(nèi)熒光染色位置具相關(guān)性有關(guān)[5-7]；RA中ANA陽性率高達72.3%，且以均質(zhì)型為主，與文獻報道[8]較為一致，RA患者中檢出抗ds-DNA抗體（2.8%）、抗Sm抗體（1.2%），可能與上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院就診患者疾病復雜性相關(guān)，部分患者并發(fā)SLE；PBC、AIH核型以混合型、胞漿顆粒型陽性率較高，主要與PBC、AIH血清中常見的特異性抗線粒體抗體、gp210、sp100、抗平滑肌抗體等靶抗原陽性有關(guān)[9]，說明通過某些特殊核型分析可為AID（如PBC/AIH）診斷提供重要依據(jù)。

各類AID患者ANA滴度（中位數(shù)），除AS（1∶80）、RA（1∶160）、IM（1∶160）外，以高滴度（≥1∶320）為主，與周仁芳[4]等的大樣本研究結(jié)果相符。RA患者可檢出低滴度ANA，主要原因可能為RA的特異性抗體如抗角蛋白抗體主要識別食管上皮細胞的絲集蛋白[10]，故少見以Hep-2細胞為基質(zhì)的ANA呈高滴度陽性；另一種可能的原因是AID的發(fā)病機制復雜，每種AID都可產(chǎn)生各種不同種類或不同親合力的自身抗體，造成某些AID以低滴度ANA檢出為主，有文獻報道AS患者ANA陽性率在18%左右，且以低滴度為主[6]，與本研究結(jié)果一致。因此，在診斷AS、RA、IM時ANA滴度的參考意義不大。

目前有關(guān) ANA 核型、滴度與病情活動的相關(guān)性報道比較少，本研究發(fā)現(xiàn)SLE患者抗ds-DNA抗體陽性組的ANA滴度（中位數(shù)）明顯高于抗ds-DNA抗體陰性組（P＜0.01），ANA滴度也與可作為病情監(jiān)測指標的抗ds-DNA抗體呈正相關(guān)（r=0.394，P＜0.01）。小兒SLE在很多方面與成人SLE相似，但小兒SLE臨床表現(xiàn)多樣、嚴重程度相差懸殊，該疾病病因不明確。有文獻報道抗SSA抗體、抗SSB抗體屬于IgG型自身抗體，可經(jīng)過胎盤屏障進入胎兒的血液循環(huán)，與胎兒或新生兒狼瘡發(fā)生相關(guān)[11]。本研究小兒SLE組女性占比明顯少于成人SLE組（P＜0.01），與堯雨根[12]的研究結(jié)果相符；成人SLE組ANA、抗ds-DNA抗體、抗Nuc抗體、抗U1RNP抗體陽性率明顯高于小兒SLE組 （P＜0.05），可能與小兒起病隱匿、疾病初期血清ANA少，醫(yī)學技術(shù)的進步和人們健康意識的提高，早在發(fā)病前確診等有關(guān)。

ANA在“健康人群”呈弱表達，在一定程度上干擾了AID的早期診斷。在本研究健康體檢人群中ANA陽性率為12.8%，與錢培新等[13]報道的13.45%相近，而ANA在健康人群中的陽性率會隨著年齡增加而升高，70歲以上的老年人ANA陽性率可達21.32%[14]。目前ANA陽性滴度臨界值仍存在較大的爭議，國內(nèi)缺乏統(tǒng)一的滴度稀釋系統(tǒng)和標準化報告程序。同時，自身抗體檢測的敏感性和特異性往往相悖，因此臨界值的設(shè)定很重要，而實際應用中根據(jù)不同的檢測目的，可能需要設(shè)定不同的臨界值。本研究對AID組與健康體檢組ANA滴度的診斷效能進行ROC曲線分析，結(jié)果顯示1∶80滴度敏感性（97.1%）好，特異性（38.7%）差，適合健康體檢篩查；1∶160滴度敏感性（80.1%）、特異性（80.8%）均較為理想，適合疾病輔助診斷。

通過本次分析，了解不同AID患者ANA核型、滴度分布情況，風濕類AID以均質(zhì)型、核顆粒型為主，消化類AID則以混合型和胞漿顆粒型為主，除AS、RA、IM外，其他AID均以高滴度（≥1∶320）為主，說明通過某些特殊核型分析可為AID（如PBC/AH）的診斷提供重要依據(jù)；SLE患者中ANA滴度與抗ds-DNA抗體呈正相關(guān)，臨床應重視ANA核型和滴度的臨床價值。另外，臨床可將1∶160作為ANA陽性臨界值，而1∶80滴度適合用于健康體檢篩查。

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