胡越，高犁，蔣瑞馨

(無錫市中心血站檢驗科，江蘇 無錫 214021)

HBV、HCV和HIV等傳染病的經(jīng)血傳播一直是影響輸血安全的關(guān)鍵因素。根據(jù)國家《獻血者健康檢查要求》的規(guī)定，血站必須對獻血者血液標本進行乙肝表面抗原、丙肝抗體和艾滋病抗體酶免檢測。這雖然大大降低了經(jīng)血傳播疾病的風(fēng)險，但由于酶免檢測存在較長的“窗口期”，仍無法完全避免輸血傳播疾病的發(fā)生[1]。而且有部分處于乙肝隱匿性感染狀態(tài)下的獻血者獻血，這是常規(guī)酶免檢測方法無法篩查出來的[2]。近年來，具有高敏感度、高特異性的核酸擴增檢測技術(shù)（NAT）在部分發(fā)達國家的獻血者篩查中得到應(yīng)用，極大地縮短了乙肝表面抗原、丙肝抗體和艾滋病抗體檢測的“窗口期”，因酶免檢測漏檢而導(dǎo)致的輸血后病毒感染顯著減少[3]。為摸索適合本站實際情況的核酸擴增檢測方案，筆者對本站129299份酶免檢測合格的獻血者血液標本使用美國羅氏診斷公司核酸聯(lián)合檢測試劑盒進行核酸擴增檢測，以分析羅氏MPX試劑在無錫地區(qū)獻血者篩查中應(yīng)用情況。

1 材料與方法

1．1 標本來源 2013年4月至2016年5月本站酶免檢測合格的獻血者血液標本129299人份。

1．2 儀器 STAR全自動加樣系統(tǒng)、FAME酶免處理系統(tǒng)、哈密爾頓全自動混樣儀、羅氏核酸提取儀、羅氏核酸擴增檢測儀、DL-5M低溫離心機。

1．3 試劑 美國羅氏診斷公司乙肝、丙肝、人類免疫缺陷病毒（1+2）NAT檢測試劑盒（Cobas Taq-Screen MPX）。北京萬泰生物藥業(yè)公司，廈門英科新創(chuàng)科技公司，北京科衛(wèi)生物科技公司乙肝、丙肝、人類免疫缺陷病毒ELISA檢測試劑盒。

1．4 方法 獻血者采血結(jié)束后留取3管血液標本（2支用于酶免等常規(guī)檢測；1支用于核酸擴增檢測）。血液采集后按要求及時離心，4℃冰箱保存。第二日先進行酶免檢測，檢測結(jié)果為陰性的血液標本則進行核酸擴增檢測。用哈密爾頓全自動混樣儀、羅氏核酸提取、擴增與檢測儀對血液標本進行混樣和檢測。每6份血液標本分別吸取167μl進行匯集后用于合并檢測核酸。每批檢測均設(shè)置一個陰性對照和三個陽性對照，每個歸集混樣管均含有內(nèi)標對照（IC）。陰性對照不能檢測到擴增信號，而陽性對照和內(nèi)標對照能檢測到的擴增信號應(yīng)符合試劑盒要求，否則本批實驗結(jié)果均為無效結(jié)果。若1個歸集混樣管的檢測結(jié)果為陰性，則該歸集混樣管中的6個標本均為陰性；若1個歸集混樣管的檢測結(jié)果為陽性，則需要對該歸集混樣管中的6個標本做單獨拆分檢測，根據(jù)單個標本檢測結(jié)果來判定為NAT陽性或者NAT陰性。

將判定為NAT陽性的血液標本冷凍保存，統(tǒng)一送江蘇省血液中心作確認實驗和定量分析，對乙肝NAT陽性的血液標本用化學(xué)發(fā)光免疫檢測系統(tǒng)做乙肝“兩對半”檢測。對酶免檢測陰性、核酸擴增檢測陽性的獻血者進行追蹤，采集血液標本進行重復(fù)酶免檢測和核酸擴增檢測。

2 結(jié)果

對酶免檢測為陰性的129299人份血液標本進行核酸擴增檢測，共檢測出HBV DNA陽性129例，HCV RNA陽性1例，HIV RNA陽性1例。對129例HBV DNA陽性血液進行HBV熒光定量檢測，共發(fā)現(xiàn)65例病毒拷貝數(shù)＜20IU/ml，16例病毒拷貝數(shù)＞50IU/ml，剩余48例定量試驗呈陰性。81例HBV DNA陽性標本經(jīng)化學(xué)發(fā)光法檢測有73例為乙肝e抗體(HBeAb)和核心抗體(HBcAb)陽性。對7例HBV DNA陽性獻血者于獻血30d后采集血樣進行檢測，仍然為HBsAg陰性，HBV DNA陽性。HCV RNA陽性血液首次病毒定量為 4．27×106IU/ml，32d后本血站對該名獻血員采血復(fù)查，抗-HCV ELISA檢測為陽性，核酸檢測均有反應(yīng)性，核酸定量檢測病毒載量為 4．68×103IU/ml。 對 1例 HIV RNA陽性獻血者首次和隨訪兩次檢測結(jié)果見表1。

3 討論

核酸擴增檢測技術(shù)在我國獻血者血液篩查方面的優(yōu)勢日益明顯。研究表明隱匿性乙肝感染者與處于乙肝血清標志物轉(zhuǎn)陽前（窗口期）的獻血者是造成乙肝表面抗原酶免檢測后仍然導(dǎo)致輸血感染乙肝的主要原因[2]，處于“窗口期”的獻血者的乙肝血清標志物會隨時間延長而轉(zhuǎn)為陽性，而隱匿性乙肝感染者的乙肝血清標志物一般不會轉(zhuǎn)為陽性[4]。實驗結(jié)果中81例HBV DNA陽性標本經(jīng)化學(xué)發(fā)光法檢測有73例為乙肝e抗體(HBeAb)和核心抗體(HBcAb)陽性，判斷其為乙肝病毒攜帶者或乙肝感染恢復(fù)期。對7例HBV DNA陽性獻血者于獻血30d后采集血樣進行檢測，仍然為HBsAg陰性，HBV DNA陽性，符合隱匿型乙肝感染（OBI）的表現(xiàn)。

窗口期一般是指從人體被病毒感染到人體外周血能檢測出該病毒標志物的這段時間，如進口酶免試劑做乙肝表面抗原、丙肝抗體和艾滋病抗體檢測的平均“窗口期”分別為 46d、71d、23d[5]，混樣核酸擴增檢測可將HBV、HCV和HIV檢測的 “窗口期”縮短到23d、58d和12d[6]。根據(jù)對HCV RNA陽性獻血者和HIV RNA陽性獻血者的追蹤檢測，證實這分別是1例處于HCV感染 “窗口期”和1例處于HIV感染“窗口期”的獻血者。盡管核酸擴增檢測只能縮短檢測感染的“窗口期”，但處在核酸檢測“窗口期”的血液傳染性極低，不少研究均表明核酸擴增檢測與酶免檢測的檢測結(jié)果有互補之效，可降低因酶免檢測漏檢而產(chǎn)生的輸血后病毒感染幾率，顯著提高輸血安全性[7-9]。根據(jù)本人的核酸檢測結(jié)果證明，美國羅氏診斷公司核酸聯(lián)合檢測試劑盒應(yīng)用于獻血者血液篩查后，能在酶免檢測陰性的血液標本中進一步篩查出乙肝、丙肝和艾滋病核酸陽性的獻血者標本，避免了臨床患者因輸血而感染乙肝、丙肝和艾滋病的不良事件，產(chǎn)生了良好的社會效益。

核酸擴增檢測技術(shù)可以忽略個體間的免疫應(yīng)答差異，能較早檢測出樣本中含量極低的病毒核酸成分，大大縮短檢測的“窗口期”，它與酶免檢測的原理和方法各不相同，所以將兩者結(jié)合在一起用于血液檢測，先進行酶免檢測去除陽性標本，再進行核酸檢測，不僅降低了核酸檢測工作量，而且消除了陽性標本易引起污染的影響因素[10]。同時核酸擴增檢測又有別于傳統(tǒng)的酶免血清學(xué)檢測，實驗操作不當極易造成假陽性和假陰性，它對標本處理方式、檢驗操作規(guī)程、室內(nèi)質(zhì)控、實驗室設(shè)備和布局等問題有著更為嚴格的要求，這些問題還有待進一步的探討。

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