藍(lán)惠華， 張 玲， 王瑋瑋， 楊 艷， 程 玲， 駱園園， 金丹丹， 王厚照

(廈門(mén)大學(xué)附屬成功醫(yī)院 檢驗(yàn)科,福建 廈門(mén) 361003)

質(zhì)粒編碼的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(Extended Spectrum Beta-Lactamases，ESBLs)是革蘭陰性桿菌中抵抗β-內(nèi)酰胺酶類(lèi)抗生素的最主要機(jī)制之一，自20世紀(jì)80年代初首次報(bào)道以來(lái)，β-內(nèi)酰胺酶類(lèi)抗生素尤其是廣譜頭孢菌素的濫用，是導(dǎo)致產(chǎn)ESBLs菌株廣泛流行的主要因素[1]。產(chǎn)ESBL大腸埃希菌(ESBL-EC)是目前臨床分離的最常見(jiàn)的產(chǎn)ESBLs菌株，可引起醫(yī)院許多嚴(yán)重和致命性感染，如腦膜炎和血液感染等。整合子與細(xì)菌多重耐藥和耐藥基因播散密切相關(guān)，為了解ESBL-EC的β-內(nèi)酰胺類(lèi)獲得性耐藥基因與整合子遺傳標(biāo)記存在狀況，對(duì)98株ESBL-EC進(jìn)行了14種β-內(nèi)酰胺類(lèi)獲得性耐藥基因以及3種整合子標(biāo)記(Intl1、Intl2和Intl3)檢測(cè)，為臨床治療、預(yù)防產(chǎn)ESBLs 細(xì)菌引起的感染提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象 分離的ESBL-EC菌株來(lái)源于2014年1月至12月廈門(mén)大學(xué)附屬成功醫(yī)院住院患者的中段尿、陰道分泌物、血液等標(biāo)本，剔除同病例相同部位重復(fù)分離的菌株，共98株。質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌 ATCC27853，由該院微生物室保存提供。

1.1.2 儀器和試劑 生物安全柜(HFSAFE-1200B2)，哥倫比亞血瓊脂平板(鄭州安圖)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(MCO-15AC)，VITEK-Compact 2全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)(法國(guó)梅里埃公司)，Micro17R微量冷凍離心機(jī)，Thermo微量移液器，恒溫金屬浴，XW-80A型旋渦混合器，Nanophotometer超微量可見(jiàn)分光光度計(jì)，BIO-Rad S1000基因擴(kuò)增儀，BIO-Rad電泳儀，BIO-Rad凝膠成像系統(tǒng)。dNTPs、TaqDNA聚合酶、蛋白酶K和DNA Marker由TaKaRa公司提供；TBE電泳緩沖液由實(shí)驗(yàn)室自配；MH瓊脂和藥敏紙片購(gòu)自英國(guó)OXOID公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離和鑒定及藥物敏感試驗(yàn) 采用VITEK-Compact 2全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)配套的鑒定卡和藥敏卡進(jìn)行細(xì)菌鑒定及藥敏。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)菌的檢測(cè)則采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLs)推薦的雙紙片法。結(jié)果按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI 2013 年版)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀[2]。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 耐藥基因引物由上海生工生物工程有限公司合成，見(jiàn)表1。

1.2.3 DNA模板制備[6]將菌株接種血平板，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，取少許純培養(yǎng)菌落于裝有200 μL無(wú)菌蒸餾水的1.5 mL EP管中，充分震蕩混勻。恒溫金屬浴100 ℃煮沸10 min，煮沸時(shí)防止管蓋爆開(kāi)，取出冷卻，14 000 r/min離心10 min，取上清，采用超微量可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)提取的DNA含量，用無(wú)菌蒸餾水調(diào)整為實(shí)驗(yàn)所需濃度(200～300 ng/μL)。

1.2.4 基因檢測(cè) 采用 PCR法檢測(cè)，引物及目的片段大小見(jiàn)表1，反應(yīng)體系總體積為50 μL，其中10×PCR buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl23 μL，1 mmol/L dNTPs 4 μL，上下游引物各 1 μL，DNA模板 2 μL，Taq酶0.3 μL，無(wú)菌水補(bǔ)充至50 μL。整合子基因反應(yīng)條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min，62 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因反應(yīng)條件：93 ℃ 2 min；93 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中(含0.5 g/mL溴化乙錠)，120 V 電壓，電泳40 min，凝膠成像儀觀察結(jié)果，并拍照保存。

表1 基因引物序列、產(chǎn)物終長(zhǎng)度及退火溫度

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 利用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，耐藥率的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 ESBL-EC菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

98株ESBL-EC對(duì)抗菌藥物耐藥情況嚴(yán)重，對(duì)氨芐西林、哌拉西林、頭孢唑啉、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢吡肟、氨曲南、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、四環(huán)素、慶大霉素耐藥率較高，耐藥率均大于50%，對(duì)妥布霉素耐藥率為31.62%，呋喃妥因、阿莫西林/克拉維酸和阿米卡星較敏感，分別為11.11%、13.4%和6.12%；對(duì)替加環(huán)素、哌拉西林/他唑巴坦、亞胺培南和厄他培南最敏感，未見(jiàn)耐藥菌株(表2)。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2.1 整合子基因型 98株ESBL-EC中，47.96%(47/98)的分離菌株為Ⅰ類(lèi)整合子陽(yáng)性，3.06%(3/98) 的分離菌株為Ⅱ類(lèi)整合子陽(yáng)性，所有菌株中有1株同時(shí)含Ⅰ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)整合子，未檢出Ⅲ類(lèi)整合子。電泳圖見(jiàn)圖1～2。整合子陽(yáng)性與陰性菌株的耐藥率，除四環(huán)素與復(fù)方新諾明具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，其余抗生素差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

圖1 Ⅰ類(lèi)整合子遺傳標(biāo)記電泳圖Fig.1 Electrophorogram of Intl1 amplified productsM1：DNA markerⅠ；P：陽(yáng)性對(duì)照；N：陰性對(duì)照；9～12、14：陽(yáng)性菌株；13：陰性菌株M1:DNA markerⅠ；P: Positive control; N: Negative control; 9-12, 14: Positive samples; 13: Negative sample

圖2 Ⅱ類(lèi)整合子遺傳標(biāo)記電泳圖Fig.2 Electrophorogram of Intl2 amplified productsM2：DNA markerⅡ；P：陽(yáng)性對(duì)照；N：陰性對(duì)照；1～6：陰性菌株；7：陽(yáng)性菌株M2: DNA markerⅡ; P: Positive control; N: Negative control; 1-6: Negative samples; 7: Positive sample

抗生素總耐藥率/%整合子陽(yáng)性菌株(n=49)敏感(S) 中介(I) 耐藥(R)整合子陰性菌株(n=49)敏感(S) 中介(I) 耐藥(R)χ2P氨芐西林100.000.000.00100.000.000.00100.00--阿莫西林/克拉維酸13.4058.3333.338.3351.0230.6118.372.2170.136哌拉西林100.000.000.00100.000.000.00100.00--哌拉西林/他唑巴坦0.00100.000.000.00100.000.000.00--頭孢唑啉100.000.000.00100.000.000.00100.00--頭孢噻肟100.000.000.00100.000.000.00100.00--頭孢曲松100.000.000.00100.002.040.0097.961.0000.500頭孢他啶81.4013.040.0086.9625.000.0075.002.4500.118頭孢吡肟51.0246.942.0451.0244.904.0851.050.0001.000氨曲南72.4524.490.0075.5130.610.0069.390.4600.498復(fù)方新諾明67.3514.290.0085.7151.020.0048.9815.034<0.001環(huán)丙沙星70.4130.614.0865.3124.490.0075.510.6540.419左氧氟沙星63.2732.6510.2057.1426.534.0869.391.5810.209妥布霉素31.6215.0014.0020.0025.0013.0011.003.8220.051替加環(huán)素0.00100.000.000.00100.000.000.00--四環(huán)素76.748.700.0091.3040.000.0060.0014.126<0.001呋喃妥因11.1168.9713.7917.2470.5923.535.892.5600.110亞胺培南0.00100.000.000.00100.000.000.00--厄他培南0.00100.000.000.00100.000.000.00--慶大霉素60.2030.610.0063.3948.980.0051.021.5000.221阿米卡星6.1289.800.0010.2097.960.002.04-0.204

注：“-”表示無(wú)相關(guān)的統(tǒng)計(jì)量

2.2.2 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因型 98株ESBL-EC中，TEM基因陽(yáng)性61株(62.24%)，CTX-M-9基因陽(yáng)性52株(53.06%)，CTX-M-1基因陽(yáng)性32株(32.65%)，CTX-M-2基因陽(yáng)性4株(4.08%)，SHV基因陽(yáng)性3株(3.06%)，7株未檢出基因型(7.14%)?；蚍植家訲EM+CTX-M-9基因陽(yáng)性組(共30株)最多見(jiàn)，占30.61%，單CTX-M-9基因陽(yáng)性組(共16株)和TEM+CTX-M1基因陽(yáng)性組(共15株)較多見(jiàn)，分別占16.33%和15.31%，單TEM基因陽(yáng)性組和單CTX-M1基因陽(yáng)性組分別占10.2%和12.24%。TEM和CTX-M-9基因電泳圖見(jiàn)圖3、圖4。各基因型檢出情況及分布見(jiàn)表3。

圖3 CTX-M-9基因PCR電泳圖Fig.3 Electrophorogram of CTX-M-9 gene amplified productsM2：DNA markerⅡ；P：陽(yáng)性對(duì)照；N：陰性對(duì)照；68、69、71、73：陽(yáng)性菌株；70、72：陰性菌株M2: DNA markerⅡ; P: Positive control; N: Negative control; 68, 69, 71, 73: Positive samples;70,72: Negative samples

圖4 TEM基因PCR電泳圖Fig.4 Electrophorogram of TEM gene amplified productsM1：DNA markerⅠ；P：陽(yáng)性對(duì)照；N：陰性對(duì)照；1、2、5～7：陽(yáng)性菌株；3、4、8：陰性菌株M1:DNA markerⅠ; P: Positive control; N: Negative control; 1, 2, 5-7: Positive samples; 3,4,8: Negative samples

基因型菌株數(shù)構(gòu)成比/%TEM1010.20CTX-M-11212.24CTX-M-91616.33SHV11.02TEM+CTX-M-11515.31TEM+CTX-M-93030.61CTX-M-1+CTX-M-211.02CTX-M-2+CTX-M-911.02TEM+CTX-M-9+CTX-M-122.04TEM+CTX-M-1+CTX-M-211.02TEM+CTX-M-9+SHV22.04未分類(lèi)型別77.14合計(jì)9899.99

3 討 論

大腸埃希菌是臨床常見(jiàn)的條件致病菌，也是醫(yī)院感染的常見(jiàn)致病菌。近年來(lái)，由于臨床上廣泛使用β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素(尤其是頭孢菌素類(lèi)抗生素)治療大腸埃希菌感染性疾病，導(dǎo)致產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺的大腸埃希菌(ESBLs-producingEscherichiacoli，ESBL-EC)的分離率越來(lái)越多，并引起國(guó)內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注。例如歐洲ESBL-EC分離率由冰島的5%到保加利亞的近40%，平均占12.6%[7]；而在中國(guó)、印度或中東的ESBL-EC檢出率更高，如2012年報(bào)道的印度檢出率高達(dá)76.8%[8]；CHINET監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，2014年度我國(guó)ESBL-EC檢出率為55.8%[9]，因而持續(xù)的監(jiān)控系統(tǒng)和有效的感染控制措施是必要的。

ESBLs由質(zhì)粒介導(dǎo)，可通過(guò)接合、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)等形式使耐藥基因在同種屬甚至不同種屬細(xì)菌間傳遞擴(kuò)散，給臨床治療帶來(lái)眾多問(wèn)題。本研究藥敏結(jié)果顯示：ESBL-EC菌株對(duì)青霉素類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)(除阿米卡星外)、喹諾酮類(lèi)等抗菌藥物耐藥率均較高，這可能是由于ESBLs是β-內(nèi)酰胺酶基因發(fā)生突變導(dǎo)致氨基酸的改變，由質(zhì)粒攜帶，可使氨基糖苷類(lèi)、喹諾酮類(lèi)等抗菌藥物的耐藥基因在細(xì)菌之間傳遞擴(kuò)散相關(guān)[10]。對(duì)阿米卡星耐藥率比較低，但是阿米卡星具有腎毒性、耳毒性，臨床上應(yīng)慎重使用。對(duì)替加環(huán)素、哌拉西林/他唑巴坦、亞胺培南和厄他培南極敏感，因此建議在臨床治療中可根據(jù)患者的病情、實(shí)際情況選擇這些抗菌藥物。

隨著新型β-內(nèi)酰胺酶的不斷產(chǎn)生，ESBLs基因型也越來(lái)越多，各種ESBLs基因型間的遺傳背景及功能特征有一定的差異，因此，對(duì)ESBLs基因型再細(xì)分研究是必要的。ESBLs在世界各國(guó)廣泛流行，但不同國(guó)家、不同地區(qū)流行的ESBLs基因型有一定的差異。例如，日本以Toho-1型和SHV型為主[11]；美國(guó)以TEM-10、TEM-12和TEM-26為主[12]；非洲以TEM-53、TEM-63為主[13]；我國(guó)以CTX-M型為主，但其流行的亞型種類(lèi)各異[14-15]。本研究表明，CTX-M型(81.63%)最普遍，TEM型次之(61.22%)，與蔣鴻超等[16]的報(bào)道相符。本研究中大部分臨床分離菌株檢出2種或2種以上的基因型(60.20%)，以TEM+CTX-M-9陽(yáng)性組(30.61%)最常見(jiàn)，說(shuō)明多重耐藥在臨床分離菌普遍存在。本研究除檢測(cè)CTX-M、TEM和SHV型基因外，還進(jìn)行CARB、LAP、KLSU、SCO、PER、GES、VEB等基因的擴(kuò)增，但均為陰性，可能與ESBL基因型具有集中趨勢(shì)及存在明顯的地域差異相關(guān)，也可能與本研究所選取菌株數(shù)量有限相關(guān)。

整合子是存在于細(xì)菌質(zhì)?；蛉旧w上基因捕獲和表達(dá)的可移動(dòng)遺傳單位，由5′保守末端和3′保守末端及兩者間的可變區(qū)三部分組成，可攜帶多種耐藥基因盒，包括對(duì)氨基糖苷類(lèi)、喹喏酮類(lèi)、磺胺和消毒劑等耐藥的基因，與細(xì)菌多重耐藥和耐藥基因的播散密切相關(guān)[10]。在大腸埃希菌的研究中目前發(fā)現(xiàn)了Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ類(lèi)整合子，其中以Ⅰ類(lèi)整合子最為常見(jiàn)[17]。本研究98株ESBL-EC 中47株攜帶Ⅰ類(lèi)整合子(47.96%)，3株攜帶Ⅱ整合子(3.06%)，大多為多重耐藥菌株，可見(jiàn)Ⅰ類(lèi)整合子廣泛存在于ESBL-EC菌株中，并可能影響其抗生素耐藥水平。而本研究結(jié)果，對(duì)于ESBL-EC株，整合子陽(yáng)性與整合子陰性除了對(duì)四環(huán)素和復(fù)方新諾明的耐藥率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)外，對(duì)其他抗生素的耐藥率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，尚不足以證明整合子的存在可影響ESBL-EC菌株抗生素耐藥水平，這與國(guó)內(nèi)報(bào)道[15-16]有一定的差異，可能與不同地區(qū)和醫(yī)院所使用的抗生素種類(lèi)、劑量及時(shí)間不同，造成對(duì)產(chǎn)ESBLs菌株的篩選及誘導(dǎo)不同，以及所收集的標(biāo)本來(lái)源不一樣等多方面原因造成的。

由于本研究收集的菌株僅來(lái)源于某三甲醫(yī)院住院患者分離的標(biāo)本，尚不能代表該地區(qū)的具體情況，關(guān)于整合子對(duì)ESBL-EC株耐藥性的影響，還有待擴(kuò)大樣本，多收集幾家三甲醫(yī)院的菌株進(jìn)一步對(duì)比研究，以增加說(shuō)服力。同時(shí)，對(duì)整合子與ESBLs各基因型之間的關(guān)系及其在耐藥傳播中的具體作用還需進(jìn)一步深入研究討論，這對(duì)有效遏制耐藥基因的傳播以期達(dá)到控制多重耐藥菌株的產(chǎn)生和播散具有深遠(yuǎn)的意義。

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