王 瀚 ，卓平清 ，王讓軍 ，葉文斌 ，王弋博 ，周 峰

（1.隴南師范高等?？茖W校 農(nóng)林技術(shù)學院， 甘肅 隴南 742500；2.隴南特色農(nóng)業(yè)生物資源研究開發(fā)中心， 甘肅 隴南 742500；3.天水師范學院 生物工程與技術(shù)學院， 甘肅 天水 741000；4.中國農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學院，北京 100193）

中國是核桃屬Juglans植物的發(fā)源地[1]。近年來，核桃作為一種經(jīng)濟價值較大的林果樹種受到人們的普遍關注。核桃黑斑病是一種嚴重的細菌性病害，其傳播能力強、危害程度高，嚴重威脅核桃生產(chǎn)安全。該病常常造成葉片和果實的黑斑，造成落葉、落果，嚴重影響果農(nóng)收入[2]。據(jù)報道該病病原菌為Xanthomonas arboricola pv,Juglandis[3]。但由于環(huán)境條件的改變，該病常會產(chǎn)生一些致病變種。本研究表明，核桃黑斑病病原菌Xanthomonas campestris pv. Campestris是引發(fā)甘肅隴南地區(qū)核桃黑斑病爆發(fā)的一種重要病原菌。

生物防治是一種綠色環(huán)保的有害生物防治方法。通過細菌間拮抗作用來防治一些重要的細菌病害越來越受到國內(nèi)外研究者的重視[4-6]。早在1958年，張素雅就以放線菌作為拮抗菌來研究對其他菌株的拮抗作用[7]。幾十年來，隨著我國農(nóng)業(yè)生物技術(shù)的發(fā)展，針對植物病原菌的拮抗細菌篩選的研究工作得到了極大發(fā)展，研究報道數(shù)量也急劇增加。目前，拮抗菌已在多數(shù)農(nóng)作物及中藥材病害防治方面成功應用，如黃芪[8]、辣椒[9]、黃瓜[10]、馬鈴薯[11]、蘋果[12]、水稻等[13]。部分成果已轉(zhuǎn)化為重要的生防農(nóng)藥，逐步得到推廣應用。本研究以核桃黑斑病病原菌Xanthomonas campestrispv.Campestris為靶細菌，通過室內(nèi)靶向多重篩選的方法，獲得了具有較好拮抗作用的菌株并對其進行了分子鑒定，以期為后期開發(fā)生防農(nóng)藥奠定堅實的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試土壤

從甘肅省隴南成縣農(nóng)業(yè)觀光園核桃園區(qū)隨機采集核桃樹根際土壤，用自封袋裝好后帶回實驗室，保存至4 ℃冰箱，用于拮抗菌的分離。

1.1.2 目標菌株

本實驗從核桃病害部位分離到的是核桃黑斑病病原菌Xanthomonas campestrispv.Campestris。

1.1.3 供試培養(yǎng)基及試劑

篩選用培養(yǎng)基為常規(guī)LB培養(yǎng)基。Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒、dNTP、Sanprep柱式DNAJ膠回收試劑盒、細菌16S rDNA通用引物及Sanprep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒等試劑均購自上海生工有限公司；TaqDNA聚合酶購自MBI；pMD-18T克隆載體購自Takara。

1.2 方 法

1.2.1 菌株的分離與純化

將10 g土樣加入到90 mL無菌水中充分溶解，在28 ℃的搖床上振蕩30 min，適當稀釋后取土壤懸液0.1 mL涂布在固體LB平板上，于28 ℃培養(yǎng)48 h后，隨機挑取單克隆，分別劃線于平板上進行細菌純化，之后挑取培養(yǎng)特征差異明顯的菌落將其接種于LB斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待菌落長出后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 拮抗菌的篩選

采用改良對峙培養(yǎng)法進行拮抗菌的篩選（見圖1）。首先在平板背部中心按照2 cm×2 cm劃線形成正方形區(qū)域，在正方形區(qū)域內(nèi)，用直徑為5 mm無菌濾紙塊蘸取病原菌Xanthomonas campestrispv.Campestris菌液，將其貼于正方形瓊脂平板中心。正方形外圍則均勻涂布土壤分離菌株。對照組（CK）則只在正方形瓊脂平板中心粘貼含病原菌Xanthomonas campestrispv.Campestris菌液的濾紙片，之后將所有平板倒置于恒溫培養(yǎng)箱，于28 ℃條件下培養(yǎng)7 d。待菌落長出后，測量相應菌落直徑，統(tǒng)計處理數(shù)據(jù)。

圖1 JK-2、JK-3、JK-12及JK-18菌株對核桃黑斑病病原菌的平板拮抗作用Fig.1 Plate antagonism of JK-2, JK-3, JK-12 and JK-18 strains against X. campestris pv. Campestris

抑制效果采用抑制率表示：抑制率=[(對照平板菌落直徑－濾紙片直徑)－(處理組平板菌落直徑－濾紙片直徑)]/(對照平板菌落直徑－濾紙片直徑)×100%。

1.2.3 拮抗菌的鑒定

形態(tài)學鑒定包括菌落形態(tài)、單個菌體形態(tài)、革蘭氏染色及有無芽孢。16S rDNA分子鑒定：利用LB液體培養(yǎng)基，于30 ℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)病原菌，16 h后收集細菌，細菌總DNA提取按照SK8255試劑盒所提供的提取方法進行。選用細菌通用引物（7F：AGTTTGATCMTGGCTCAG，1540R: GGTTACCTTGTTACGACTT），以細菌總DNA為模板進行PCR擴增。反應體系（25 μL）為：DNA 模板為 0.5 μL，10 × PCR Buffer 2.5 μL，dNTP為1μL，Taq 酶 0.2 μL，ddH2O 補加至 25 μL。擴增程序：94 ℃變性5 min；94 ℃ 43 sec；55 ℃42 sec；72 ℃2min，32 個循環(huán)；72 ℃延伸12min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至上海生工有限公司進行測序，測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌的分離和篩選

采用平板稀釋法從土壤懸液中共分離出120株形態(tài)不同的菌株，經(jīng)過初篩，共得到18株具有較好拮抗作用的菌株，分別編號為JK-1～JK-18（見表1）。經(jīng)利用平板對峙法篩選，發(fā)現(xiàn)有5株對病原菌Xanthomonas campestrispv.Campestris的抑制率達到80%以上，分別是JK-2（94.30%）、JK-3（82.20%）、 JK-12（87.30%）、JK-14（88.10%）、JK-18（92.30%）。抑制率為70%～80%的共2株；60%～70%的6株；60%以下的有5株；抑制率最低的為JK-8（18.20%）。故本研究中重點選擇抑制率在80%以上的菌株作為受試拮抗菌，并對其進行形態(tài)及分子鑒定。

2.2 5株拮抗能力較強拮抗菌的分子鑒定

將 JK-2、JK-3、JK-12、JK-14及 JK-18菌 株的PCR產(chǎn)物送上海生工進行測序，共獲得上述菌株16S rDNA序列5條。經(jīng)ClustalX1.8軟件拼接后，與NCBI數(shù)據(jù)庫中核苷酸序列進行BLAST分析，得到如下結(jié)果（見表2）。由表2可以看出，JK-2與JK-3、JK-12與JK-14均為同一菌株。

2.3 拮抗菌株JK-2與JK-18的鑒定

2.3.1 形態(tài)特征

菌株JK-2菌落呈淡黃色，顯微鏡下觀察可發(fā)現(xiàn)部分菌體分裂形成不規(guī)則桿菌，在較老的培養(yǎng)物全部或大部分為球狀細菌組成，為革蘭氏陽性細菌（見圖2A, D）。菌株JK-18菌落近圓形，邊緣具有缺刻，中央隆起并向四周形成典型的放射褶，顏色呈乳白色（見圖2B, C）。菌體呈桿狀，為革蘭氏陽性菌（見圖2E），菌體大小為（1.2～3.4）μm×（0.3～0.5）μm，根據(jù)上述形態(tài)特點，將其確定為芽孢桿菌屬Bacillus。

表1 拮抗菌的拮抗能力測定Table1 Antagonistic ability test of antagonistic bacteria

表2 拮抗能力較強細菌的鑒定結(jié)果Table2 Identification result of antagonistic bacteria with better antagonistic ability

2.3.2 16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育學分析

圖2 JK-2與JK-18的細菌形態(tài)Fig.2 Morphologies of JK-2 and JK-18 strains

瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果表明，拮抗菌JK-2（1 375 bp）與JK-18（1 405 bp）的16S rDNA條帶清晰，亮度高，可以進行PCR擴增實驗（見圖3）。擴增完成經(jīng)測序后獲得16S rDNA序列，序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST，挑選同源序列分值較高的代表性菌株，采用鄰接法（NJ）構(gòu)建進化樹（見圖4）。系統(tǒng)進化表明，JK-2與JK-18菌株的16S rDNA序列分別 與Arthrobacter sp.（KF805083.1） 及Bacillus mojavensis（KF254575.1）的相似程度達99%，結(jié)合菌株的形態(tài)學等特征[14]，初步鑒定JK-2為節(jié)桿菌Arthrobacter sp.、JK-18為莫海威芽孢桿菌Bacillus mojavensis。

3 討 論

近年來，利用拮抗細菌作為生物防治菌的研究報道較多，尤其在果樹病害研究領域，應用生防菌實施綠色綜合防治，是一個前景較為廣闊的研究領域。井敏敏等[15]以芒果為實驗材料，研究了不同濃度Burkholderia sp.的拮抗菌JS-8對芒果采后品質(zhì)的影響，研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)JS-8處理后芒果的果實色澤、果實硬度及可溶性物質(zhì)的變化均有所改變，并且抑制了果實中相關酸類物質(zhì)的下降，有效地延長了貯藏時間。有研究者[16]從瓜拉那Paullinia cupanavar.sorbilis幼苗中分離到102株內(nèi)共生菌，研究表明，約15%的菌株對Colletotrichum gloeosporioides具有較好的抑制作用。殷曉慧等[17]以桃褐腐病為靶向菌，分離出了死谷芽孢桿菌Bacillus vallismortis和高地芽孢桿菌B. altitudinis2株拮抗細菌，結(jié)果表明這2種拮抗菌的使用可明顯減緩桃樹褐腐病的發(fā)病時間，極大地抑制了病原菌的擴散。

圖3 拮抗菌JK-2、JK-18 PCR擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果檢測Fig.3 Electrophoretic result of PCR amplif i cation products of the antagonistic bacterial strains of JK-2 and JK-18

圖4 基于菌株JK-2、JK-18 的16S rDNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic trees of JK-2 and JK-18 strains based on 16S rDNA sequences

節(jié)桿菌Arthrobacter sp.是一種典型的土壤細菌，主要用于土壤修復與相關有害物質(zhì)的降解[18-19]。未見用于植物病害拮抗細菌的相關報道。芽孢桿菌是目前廣泛用于植物病害防治的拮抗細菌。常見的有枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌B. cereus、多粘芽孢桿菌B. polymyxa、巨大芽孢桿菌B. megaterium和短小芽孢桿菌B. pumilis等[20]。有關莫海威芽孢桿菌用于植物病害拮抗作用的研究報道較少，國內(nèi)僅楊成德等[21]報道了從珠芽蓼中分離到的莫海威芽孢桿菌ZA1對馬鈴薯壞疽病菌具有拮抗作用。暢濤等[22]研究了莫海威芽孢桿菌ZA1對馬鈴薯的防病促生作用及對其防御酶的誘導作用。

核桃病害防治研究是經(jīng)濟林研究方面一個重要的研究領域，但是，多數(shù)傳統(tǒng)的病害防治研究僅關注利用化學方法提高病害的防治率，并未考慮對環(huán)境造成的污染和破壞。近年來，關于核桃生物防治方面的研究逐漸增加，但主要集中在核桃根腐病及炭疽病的研究等方面[23-27]，對于核桃黑斑病的生物防治及拮抗菌的篩選，國內(nèi)外尚無相關報道。在本研究中，利用平板對峙法篩選到幾株拮抗效果較佳的細菌，其中JK-2節(jié)桿菌Arthrobacter sp.與JK-18莫海威芽孢桿菌Bacillus mojavensis拮抗作用最佳，極具開發(fā)潛力，但其抑菌機理及環(huán)境相容性等問題還需繼續(xù)深入研究。

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