王 娟，侯俊秀，張川江

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，呼和浩特 010050；2.內(nèi)蒙古精神衛(wèi)生中心心身科，呼和浩特 010010)

MicroRNA(miRNA)是一種非編碼RNA，可以靶向結(jié)合信使RNA(mRNA)并發(fā)揮降解或抑制其翻譯的作用，然后實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的相關(guān)調(diào)控效果。近年來人們發(fā)現(xiàn)，miRNA 作為基因表達(dá)調(diào)控分子中的重要一員，在皮膚發(fā)育、多種皮膚病以及皮膚潰瘍和創(chuàng)傷愈合過程也同樣具有重要的調(diào)節(jié)作用[1-3]。近年來國內(nèi)外相關(guān)研究也開始更多地關(guān)注其與皮膚創(chuàng)傷愈合的相關(guān)性及其在潰瘍等愈合中所起到的作用[4-5]。國外有研究提示，健康皮膚受損時(shí)miR-198 生成停止，可見miR-198 水平降低，提示機(jī)體開啟傷口愈合通道。糖尿病性潰瘍是一種病程遷延且病情復(fù)雜、處理困難的并發(fā)癥，且預(yù)后相對(duì)較差，往往久治不愈，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，這種未愈合的傷口中長期存在miR-198，會(huì)抑制傷口愈合[6-7]。本文就外周血miRNA-198表達(dá)異常與難治性糖尿病潰瘍的相關(guān)性進(jìn)行了初步探索，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年7月至2017年7月在內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院就診的48例2型糖尿病并發(fā)慢性難治性潰瘍的患者作為潰瘍組，其中男29例、女19例，平均年齡(58.29±7.03)歲，平均糖化血紅蛋白(HbA1c)水平為(9.93±2.45)%，平均糖尿病病程(15.98±3.27)年；同時(shí)選取年齡、性別具有可比性的新診斷的65例2型糖尿病無任何急、慢性并發(fā)癥患者作為單純糖尿病組，其中男40例、女25例，平均年齡(57.23±9.88)歲，平均HbA1c水平為(9.94±3.82)%，平均糖尿病病程(15.55±4.02)年；另選擇同期65例健康人作為健康組，其中男39例、女26例，平均年齡(58.04±6.39)歲，平均HbA1c水平為(5.01±0.88)%。潰瘍組和單純糖尿病組患者HbA1c水平均高于健康組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3組研究對(duì)象性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。所有糖尿病患者均符合1999年WHO關(guān)于 2型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除合并其他嚴(yán)重并發(fā)癥和其他嚴(yán)重疾病及自身免疫性疾病者。所有受試者對(duì)本研究知情同意，并簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 miRNA-198的測定采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)，主要試劑及儀器為miRNeasy血清/血漿RNA提取試劑盒、miRNeasy血清/血漿外參，均購自德國Qiagen公司；熒光定量PCR引物、TaqMan通用混合熒光定量PCR試劑盒Ⅱ、TaqMan MicroRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、ABI9700型PCR儀、ABI 7900HT Fast Read-TimePCR System，均購自美國ABI公司。

1.3方法 對(duì)全部受試對(duì)象進(jìn)行面訪，通過問卷調(diào)查收集患者超重/肥胖、高血壓現(xiàn)病史、高血壓家族史及糖尿病家族史等相關(guān)信息。然后將Ficoll-Paque PLUS液室溫放置，應(yīng)用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管收集患者早晨空腹靜脈血5 mL，取2 mL EDTA抗凝血與等體積平衡液在15 mL離心管中用移液管充分混勻，用針管抽取3 mL Ficoll Paque PLUS液至新的離心管中，輕輕用移液管沿管壁緩慢滴加準(zhǔn)備好的樣品于分層液面上離心。將血漿置于凍存管中，于-80 ℃環(huán)境下保存?zhèn)溆?。采用血液總RNA快速提取試劑盒(miRNeasy血漿提取試劑盒)提取總RNA。按照miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR按照TaqMan通用混合試劑盒Ⅱ說明書進(jìn)行。PCR Ct值通過ABI 9700實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行測定，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)2次。測定并比較患者血清中miRNA-198表達(dá)水平，對(duì)miRNA-198表達(dá)水平與難治性潰瘍之間潛在相關(guān)性進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1各組受試者超重/肥胖、糖尿病家族史、高血壓現(xiàn)病史、高血壓家族史情況 潰瘍組和單純糖尿病組患者中超重/肥胖、糖尿病家族史、高血壓現(xiàn)病史、高血壓家族史比例均高于健康組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 受試者超重/肥胖、高血壓現(xiàn)病史、糖尿病家族史、 高血壓家族史情況情況比較[n(%)]

注：與健康組相比，*P<0.05

2.23組受試者外周血中miRNA-198的表達(dá)情況比較 潰瘍組患者外周血miRNA-198表達(dá)水平為(2.67±0.42)Ct，單純糖尿病組為(2.43±0.42)Ct，健康組為(2.43±0.21)Ct，3組miRNA-198表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)一步作兩兩比較發(fā)現(xiàn)，潰瘍組水平分別高于單純糖尿病組和健康組水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；單純糖尿病組與健康組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 miRNA-198表達(dá)水平及其他相關(guān)潛在影響因素與糖尿病難治性潰瘍之間的相關(guān)性

2.3miRNA-198表達(dá)水平及相關(guān)潛在影響因素與糖尿病難治性潰瘍之間的相關(guān)性 研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-198表達(dá)水平增高可以增加1.679倍糖尿病難治性潰瘍的風(fēng)險(xiǎn)(OR值為1.679，P<0.01)；此外，超重/肥胖、高血壓現(xiàn)病史以及高血壓和糖尿病家族史都可以增加患糖尿病難治性潰瘍的風(fēng)險(xiǎn)(OR值分別為1.242、1.317、1.094、1.176,P<0.01)。見表2。

3 討 論

糖尿病本身是由遺傳因素、免疫功能因素以及環(huán)境因素等眾多致病因子作用下，機(jī)體出現(xiàn)胰島功能減退以及胰島素抵抗等而引發(fā)的糖代謝紊亂，同時(shí)還常常伴有蛋白質(zhì)、脂肪、水和電解質(zhì)等一系列代謝的穩(wěn)態(tài)失衡，是一種臨床上常見的慢性疾病，以高血糖為主要特點(diǎn)[8-9]。糖尿病慢性并發(fā)癥發(fā)生率越來越高，全球每年約有320 萬人死于糖尿病的各種并發(fā)癥，慢性并發(fā)癥已經(jīng)成為糖尿病患者致殘致死的主導(dǎo)因素。其中糖尿病性潰瘍是一種病程遷延且病情復(fù)雜、處理困難的并發(fā)癥，且預(yù)后相對(duì)較差，往往久治不愈，嚴(yán)重者還有可能導(dǎo)致截肢致殘。糖尿病潰瘍嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，而且由于治療尚缺乏高效手段，治療周期長，加之醫(yī)療費(fèi)用相對(duì)也較高，給患者家庭及社會(huì)都帶來沉重的負(fù)擔(dān)[8-10]。因此，對(duì)于糖尿病性潰瘍，特別是難治性糖尿病性潰瘍，深入探究其機(jī)制，尋求更高效的防治手段，意義重大。

我國糖尿病并發(fā)足部潰瘍引發(fā)的截肢患者近年也有所增加。糖尿病諸多慢性并發(fā)癥中包含大血管病變，比如心臟病、高血壓、腦血管意外以及下肢血管病變等；還有微血管病變，比如糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病及神經(jīng)病變等等[10-12]。其中糖尿病引發(fā)的潰瘍以及下肢動(dòng)脈和靜脈疾病引起的難愈合型的潰瘍及創(chuàng)面已經(jīng)成為糖尿病患者所面臨的主要危害之一。高血糖環(huán)境會(huì)引發(fā)創(chuàng)面無法有序、及時(shí)地修復(fù)，傷口逐漸形成潰瘍，因此糖尿病并發(fā)慢性潰瘍的發(fā)生率很高，而且潰瘍創(chuàng)面往往反復(fù)發(fā)作成遷延狀態(tài)[13-14]。

目前認(rèn)為神經(jīng)病變、缺血和創(chuàng)傷是造成糖尿病創(chuàng)面難以愈合的最重要因素[13-15]。隨著分子生物學(xué)及其相關(guān)技術(shù)的不斷發(fā)展，學(xué)者也在不斷探索糖尿病潰瘍性病變的分子機(jī)制以及微觀層面的特征。本研究針對(duì)外周血miRNA 表達(dá)狀態(tài)進(jìn)行了分析，提示3組受試者miRNA-198表達(dá)水平存在差別,進(jìn)一步做兩兩比較發(fā)現(xiàn)，潰瘍組水平分別高于單純糖尿病組和健康組水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，單純糖尿病與健康組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。其原因可能是糖尿病患者未愈合的傷口組織中長期存在miR-198，其在受損皮膚中高表達(dá)抑制了正常的皮膚受損miR-198 生成。鑒于miRNA是一種高度保守的非編碼RNA，在其調(diào)控各種病理生理的過程中是否會(huì)受到其他環(huán)境及患者自身因素的影響。本文就miRNA-198表達(dá)水平及其他相關(guān)潛在影響因素與糖尿病難治性潰瘍之間的相關(guān)性進(jìn)行了回歸分析，結(jié)果提示miRNA-198表達(dá)水平高、超重/肥胖狀態(tài)、飲酒史、高血壓現(xiàn)病史以及高血壓和糖尿病家族史均是糖尿病難治性潰瘍發(fā)生的高危因素。其原因可能是這些因素均會(huì)加劇局部炎癥，使患者皮膚易感性增加，同時(shí)長期的慢性創(chuàng)面感染狀態(tài)引發(fā)的細(xì)菌感染和局部肉芽老化等病理過程的出現(xiàn)，以及包膜纖維化出現(xiàn)，都可以致創(chuàng)面不易愈合[15]。

綜上所述，miRNA-198的表達(dá)與難治性糖尿病性潰瘍之間存在相關(guān)性，miRNA-198在外周血中的表達(dá)增高存在于難治性糖尿病性潰瘍的病理過程之中，影響了傷口的正常愈合機(jī)制。

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