彭雷+趙艷+馬銀花

摘要：褐飛虱是對水稻危害最嚴重的害蟲之一，目前缺少對褐飛虱內源高效啟動子的研究。以褐飛虱的組蛋白H3與H2A基因為研究對象，通過已知的果蠅H3與H2A序列搜尋Genbank上褐飛虱表達序列標簽（expressed sequence tags，簡稱EST）數(shù)據(jù)庫，從而獲得同源序列來設計嵌套引物。然后通過染色體步移的交錯式熱不對稱PCR（thermal asymmetric interlaced PCR，簡稱Tail-PCR）技術獲得H3與H2A ATG前側翼序列，分別為1 664、538 bp。PLACE軟件在線分析TATA框、CAAT框、GATA框。為外源基因在褐飛虱細胞內高效表達以及褐飛虱轉基因相關研究奠定基礎。

關鍵詞：褐飛虱；組蛋白H3；組蛋白H2A；啟動子；Tail-PCR；基因工程

中圖分類號： S435.112+.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）23-0030-03

在基因工程研究中常常需要目的基因高效表達，于是分離強啟動子已成為目前基因工程的基礎工作之一。高等動植物的基因調控主要是在轉錄水平上進行的，受各類順式調控元件與反式調控元件協(xié)同調控。高等生物啟動子主要分為3類，第1類為組成型表達啟動子，這類啟動子一般調控看家基因表達。組成型啟動子在所有組織中都能啟動基因的表達，具有持續(xù)性，不表現(xiàn)時空特異性；第2類為組織特異型啟動子，一般調控基因在特定組織和器官中表達；第3類為誘導型啟動子，一般受某種信號誘導開啟基因表達，讓基因在特定發(fā)育時期或特定組織器官、特定生長環(huán)境下表達[1]。其中組成型表達啟動子應用比較廣泛，主要應用于目的基因超量表達以及轉基因研究中?？醇一騽e稱持家基因（house-keeping genes），是指所有細胞中組成型表達的一類基因，其產(chǎn)物是維持細胞各種基本生命活動所必需的[2]。褐飛虱（Nilaparvata lugens Stl）是危害水稻最大的害蟲之一，我國目前有1 300萬～2 000萬hm2 水稻受到褐飛虱危害[3]，對褐飛虱的研究成為農業(yè)病蟲害防治重要課題之一。目前在褐飛虱分子生物學中缺少對其自身基因內源啟動子的研究，相關研究也較少。以分離褐飛虱看家基因啟動子序列為目的，用染色體步移技術得到組蛋白H2A與H3基因ATG前啟動子序列，并對啟動子序列進行結構與特征分析。本研究以分離組成型表達基因啟動子為目的，為外源基因在褐飛虱細胞內高效表達以及褐飛虱轉基因相關研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料與試劑

供試褐飛虱飼養(yǎng)在溫室，溫室的溫度條件為22～28 ℃，保持合適的光照和濕度條件，以保證水稻和褐飛虱在良好環(huán)境下生長。Top 10感受態(tài)細胞為筆者所在實驗室保存。Genome walking試劑盒、PMD18-T Simple Vector、DNA solution I均購自寶生物工程（大連）有限公司；PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒購自美國Omega儀器儀表有限公司；其他試劑為國產(chǎn)或進口分析純。

1.2褐飛虱DNA提取

褐飛虱基因組DNA提取皆為單頭蟲提取。所用方法為十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium ammonium bromide，簡稱CTAB）法參照文獻[4-5]，并略有改動。將采集的單頭褐飛虱放入裝有400 μL質量分數(shù)為2% CTAB的 1.5 mL 離心管中，用勻漿小棒搗碎勻漿，將勻漿液放入 60 ℃ 水浴鍋水浴裂解60 min，向裂解后的勻漿液中加入200 μL三氯甲烷/異戊醇（體積比為24 ∶1）抽提2次，加入2倍體積無水乙醇，-20 ℃條件下沉淀；最后將風干后的DNA溶于 50 μL TE中，置于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3擴增引物

目前褐飛虱H3、H2A序列還沒有被公布，用果蠅的H3、H2A mRNA序列在NCBI的褐飛虱EST數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對，這樣就獲得與果蠅H3、H2A高度同源的EST片段，以EST片段序列為模板來設計引物（表1）。

1.4Tail-PCR擴增

3輪反應總體系50 μL，包括1 μL模板；2.5 mmol/L dNTPs 8 μL；10×LA PCR Buffer Ⅱ（Mg2+ plus）5 μL；LA Taq（5 U/μL）0.5 μL；隨機引物與特異引物（100 pmol/μL）各 1 μL；加入dH2O至總體積50 μL。以H3第1次Tail-PCR為例，試劑盒的AP2、AP3、AP4引物分別首先與H3W1-1引物進行第1輪擴增，擴增產(chǎn)物為模板再加入各自對應AP簡并引物和H3W1-2進行第2輪，同理以H3W1-2和AP引物進行第3輪擴增，第3輪擴增結束后電泳跑膠并選取擴增帶型效果好的一組組合。PCR反應條件參照Genome Walking試劑盒說明書。

1.5PCR產(chǎn)物測序與序列分析

將擴增產(chǎn)物用DNA膠回收試劑盒回收后和PMD18-T載體按濃度比為3 ∶1混合，加入等體積DNA solution I，16 ℃連接5 h。將連接片段轉化Top10感受態(tài)細胞，涂布含氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基平板，37 ℃條件下培養(yǎng)過夜，挑取白色菌落。以載體通用測序引物M13-47和RV-M進行菌落PCR擴增，1%瓊脂糖電泳檢測插入片段大小，將陽性克隆的菌液送出測序。序列先在Genbank Blastn上進行比對，確定是否為目的序列。通過PLACE在線啟動子預測工具分析啟動子功能元件。

2結果與分析

2.1Tail-PCR擴增結果

對于H3基因和H2A基因各自3條特異引物和試劑盒AP2、AP3、AP4簡并引物組合，3輪熱不對稱PCR后，H3基因的AP3的組合能擴增到1條約900 bp的片段（圖1-a），H2A基因的AP3組合能擴增到1條約800 bp的片段（圖1-b）。將擴增到的片段T-A克隆測序后在Genbank上進行Blastn比對，證實為褐飛虱H3、H2A基因ATG前端序列。根據(jù)測序結果，又設計3條特異性引物繼續(xù)對H3向前walking，交錯式熱不對稱PCR（thermal asymmetric interlaced PCR，簡稱 Tail-PCR）獲得約1.1 kb片段（圖1-c），測序后將其與前面測序結果拼接。根據(jù)測序結果，獲得H3 ATG前端1 664 bp序列，獲得H2A ATG前端538 bp序列。endprint

2.2啟動子序列分析

將得到H3與H2A ATG上游序列與Genbank上的褐飛虱

EST數(shù)據(jù)庫進行比對發(fā)現(xiàn)，H3 5′非翻譯區(qū)（untranslated region，簡稱UTR）有1條549 bp的內含子（圖2），H2A起始密碼子ATG后有一段143 bp的內含子序列（圖3）。PLACE軟件在線分析預測TATA框、GAAT框、CAAT框等啟動子核心原件（圖2、圖3）。

3討論

真核生物DNA是以染色質形式存在的，而染色質的基本組成單位為核小體，核小體則由核心組蛋白組成，其組成方式為以組蛋白H2A、H2B、H3和H4各2個分子形成八聚體，DNA則纏繞在此八聚體上形成核小體[6]。茅衛(wèi)峰等克隆了虹蹲魚H3的啟動子序列并將H3啟動子插入啟動子缺失的增強綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，簡稱EGFP）表達載體pEGFP-1中，通過顯微注射法注射重組載體，結果表明，H3啟動子能啟動報告基因EGFP在各組織中的高效表達[7]。DNA未知區(qū)域序列克隆一般采用染色體步移技術，染色體步移技術主要基于2種方法，1種是基于基因組文庫為主要手段的染色體步移技術，另1種是基于PCR技術的染色體步移技術?；赑CR的染色體步移技術又主要以連接成環(huán)PCR、外源接頭介導PCR和半隨機引物PCR技術為主[8]?；陔S機引物的PCR技術的熱不對稱交錯PCR（Tail-PCR）是比較常用的獲得側翼序列的方法，由Liu等最早設計[9]，其原理是基于巢式PCR，利用3個嵌套的特異引物和1個較短的隨機簡并引物進行3次熱不對稱PCR擴增，逐漸擴增到特異性的目的基因產(chǎn)物。本研究首先通過果蠅的組蛋白H3基因和H2A基因序列在褐飛虱EST數(shù)據(jù)庫中搜尋同源序列，以此獲得褐飛虱H3、H2A基因的部分序列，然后設計嵌套特異引物，通過Tail-PCR技術獲得H3、H2A基因ATG前端序列，分別為1 664、538 bp，并對獲得的ATG前端側翼序列運用PLACE軟件在線分析其啟動子元件。本研究為外源基因在褐飛虱細胞內高效表達以及褐飛虱轉基因相關研究奠定基礎。

參考文獻：

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