王寵 吳旸 孫開爭 郭萌萌 徐國棟 張水燕

摘要：目的：探索8家實驗室糞大腸菌群（MPN法）檢測結(jié)果的一種評價方法。方法：采用Grubbs檢驗法、泊松分布置信區(qū)間法和改進(jìn)的En值法分別評價了檢測結(jié)果，結(jié)合“不合格”或“不滿意”實驗室問題追蹤結(jié)果，比較了3種方法的評價結(jié)論。結(jié)果：較其他2種方法，改進(jìn)的En值評價方法不但考慮了標(biāo)準(zhǔn)定量菌株和MPN方法的不確定度，而且還考慮了其分布特點，其評價結(jié)論更符合實際情況，更加科學(xué)合理。結(jié)論：改進(jìn)的En值評價方法適用于MPN法的準(zhǔn)確度評價，不僅可以評價能力驗證或能力考核結(jié)果，而且還可以評價日常質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度。

關(guān)鍵詞：糞大腸菌群;MPN;En值

中圖分類號：X820.3? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? 文章編號：2095-672X（2021）01-0072-06

DOI.10.16647/j.cnki.cn15-1369/X.2021.01.011

Comparison of evaluation methods for the determination of fecal coliform （MPN）

Wang Chong ，Wu Yang，Sun Kaizheng，Guo Mengmeng，Xu Guodong，Zhang Shuiyan

（Ji'nan Eco-environmental Monitoring Center of Shandong Province， Ji'nan Shandong 250101，China）

Abstract：Objective：Explore an evaluation method of fecal coliform （MPN） detection results of 8 laboratories.Method：Grubbs test method， Poisson distribution confidence interval method and improved en value method were used to evaluate the test results. Combined with the "unqualified" or "Unsatisfactory" laboratory problem tracking results， the evaluation conclusions of the three methods were compared.Result ：Compared with the other two methods， the improved en value evaluation method considered not only the uncertainty of standard quantitative strains and MPN method， but also their distribution characteristics. The evaluation conclusion is more in line with the actual situation and more scientific and reasonable.Conclusion：This method was suitable for the accuracy evaluation of MPN method， which can not only evaluate the ability verification or ability examination results， but also evaluate the accuracy of routine quality control samples.

Key words：Fecal coliform;most probable numbers; MPN;En value

最大可能數(shù)（MPN）法[1-5]很早就應(yīng)用于總大腸菌群和糞大腸菌群等微生物指標(biāo)分析。該方法是生態(tài)環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域多管發(fā)酵法[6]和酶底物法[7]的理論基礎(chǔ)，也在衛(wèi)生檢驗、食品檢驗領(lǐng)域獲得了廣泛應(yīng)用。該方法不同于平板計數(shù)法用菌落數(shù)量直觀表示測量結(jié)果，而是通過概率理論估算細(xì)菌濃度的一種方法，同時給出檢測結(jié)果的置信區(qū)間，可以是95%概率（包含因子k=2）和99%概率（包含因子k=3），因為MPN值本身的不確定度是MPN法檢測結(jié)果不確定度的主要來源，因此可以忽略其他顯著小的不確定度，該置信區(qū)間可以作為MPN值的擴(kuò)展不確定度[8]使用。該不確定度的分布與常見的正態(tài)、三角型、梯形、矩形等對稱分布不同，它屬于不對稱分布，多管發(fā)酵法MPN值的置信區(qū)間形狀類似于色譜分析中的拖尾峰，表現(xiàn)為MPN值與置信區(qū)間下限的差值小，而與置信區(qū)間上限的差值大。

糞大腸菌群直接來源于糞便，被廣泛應(yīng)用為衡量水體糞便污染的指示微生物，水體存在糞大腸菌群表明水體已被糞便污染，該項目是地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、污水綜合排放標(biāo)準(zhǔn)等各類標(biāo)準(zhǔn)的監(jiān)測指標(biāo)。多管發(fā)酵法是傳統(tǒng)的糞大腸菌群檢測方法，因具有不受濁度影響， 可以檢驗濁度較大水樣， 價格便宜等優(yōu)點，被廣泛使用。本單位組織8家實驗室開展了糞大腸菌群（MPN法）能力考核，然而，常用的統(tǒng)計方法如穩(wěn)健統(tǒng)計方法[9]、改進(jìn)的經(jīng)典統(tǒng)計法[10]和En值法[9，11]等均無法完成結(jié)果評價。如穩(wěn)健統(tǒng)計方法主要適用于15家以上實驗室參加的能力驗證/能力考核的結(jié)果評價;改進(jìn)的經(jīng)典統(tǒng)計法雖然適用于10家左右的實驗室參加的能力驗證/考核結(jié)果評價，但一般適用于有精密度限值的化學(xué)分析項目;En值法[9，11]主要適用于不確定度屬于對稱分布的結(jié)果評價，該方法使用時需實驗室提供測量結(jié)果的不確定度和指定值的不確定度，適用于1家實驗室參加的測量審核。而本次能力考核用的定量標(biāo)準(zhǔn)菌株的不確定度為對稱分布，糞大腸菌群（MPN法）檢測結(jié)果的不確定度為不對稱分布，因此，En值法也無法評價結(jié)果。針對這種情況提出了改進(jìn)的En值方法，并與Grubbs檢驗法[12]、泊松分布置信區(qū)間法[13]進(jìn)行了比較。

1? ? 能力考核

1.1? ? 考核菌株

定量標(biāo)準(zhǔn)菌株：大腸桿菌（ Escherichia coli NCTC 12241，Bioball single shot，Lot Number：B2976， BTF-A biomerieux Company Sydney Australia），標(biāo)準(zhǔn)值為31.1±5.2cfu（包含因子k=2）。

1.2? ? 考核樣品稀釋方法

臨用前小心打開小瓶，將樣品用100mL的無菌生理鹽水（0.9%）溶解，充分震蕩混勻后立即使用。

1.3? ? 檢測方法

按照多管發(fā)酵法[6]開展檢測，使用15管發(fā)酵方式，即5份10mL、5份1mL和5份0.1mL接種水樣，進(jìn)行初發(fā)酵和復(fù)發(fā)酵，結(jié)果報100mL水樣中的糞大腸菌群數(shù)最大可能數(shù)。

1.4? ? 檢測結(jié)果

8家實驗室的檢測結(jié)果及擴(kuò)展不確定，見表1。

2? ? 結(jié)果評價

2.1? ? Grubbs檢驗法

將檢測結(jié)果取以10為底的對數(shù)值，轉(zhuǎn)換成近似正態(tài)分布，然后Grubbs檢驗法進(jìn)行異常值檢驗。

2.2? ? 泊松分布置信區(qū)間法

單位體積中的分布均勻的細(xì)菌數(shù)（包括大腸桿菌、糞大腸桿菌等）符合poisson（泊松）分布。該考核樣品標(biāo)準(zhǔn)值為31.1cfu，樣品計數(shù)

X≈31，經(jīng)查poisson（泊松）分布可信區(qū)間表[13]，總體均數(shù)的置信區(qū)間（95%概率）下限值21.0，上限值44.0，用該置信區(qū)間進(jìn)行結(jié)果評價。

2.3? ? 改進(jìn)的En值評價方法

2.3.1? ? En值

式（1）中，x是實驗室的測量結(jié)果;Ux是被測物品的參考值;Ux是參加者結(jié)果的擴(kuò)展不確定度（包含因子k=2）;Ux是指定值的擴(kuò)展不確定度（包含因子k=2）。式（2）是合成不確定度計算公式，可以將Uc認(rèn)為參考值X的合成不確定度（包含因子k=2），而Ux、Ux為不確定度分量，該公式適用于不確定度對稱分布形式。

2.3.2? ? 評價方法

當(dāng)，[En]>1結(jié)果評價“滿意”;當(dāng)[En]>1，結(jié)果評價“不滿意”。也就是測量結(jié)果x落在參考值X的合成不確定度Uc（95%概率）范圍內(nèi)，則結(jié)果評價“滿意”，否則評價“不滿意”。

2.3.3? ? 改進(jìn)的En值

實質(zhì)上，公式（2）中，Uc包含2個值Uc（l）和Uc（r），其中，Uc（l）為左側(cè)不確定度，即參考值X與下限值之差，它是不確定度分量Ux（l）Ux（l）等合成的;Uc（r）為右側(cè)不確定度，即參考值X與上限值之差，它是不確定度分量Ux（r）Ux（r）等合成的。當(dāng)不確定度對稱分布時，Uc（l）和Uc（r）相等，則Uc=Uc（l）=Uc（r）。當(dāng)不確定度不對稱分布時，Uc（l）和Uc（r）不相等，則Uc也為不對稱分布，如標(biāo)準(zhǔn)定量菌株不確定度為對稱分布，MPN值的不確定度不對稱分布，則合成不確定度Uc也為不對稱分布。當(dāng)合成不確定度時，Ux有2個值Ux（l）和Ux（r），其中，Ux（l）為左側(cè)不確定度，即MPN值與下限值之差;Ux（r）為右側(cè)不確定度，即MPN值與上限值之差。在合成不確定度時，左側(cè)和右側(cè)可以按照近似正態(tài)分布分別合成不確定度，即參考值X的合成不確定度（包含因子k=2）具有左右不對稱性。當(dāng)x

公式（3）（4）中Ux=Ux（l）=Ux（r），而Ux1=Ux（l）1=Ux（r），因此，分別計算出En（l）和En（r）兩個值，因為類似拖尾峰分布特點，一般En（l）>En（r）。當(dāng)x

3? ? 結(jié)果評價

3.1? ? Grubbs檢驗法評價結(jié)論

8家實驗室的結(jié)果最大值和最小值的Gn

3.2? ? 泊松分布置信區(qū)間法評價結(jié)論

如果檢測結(jié)果在泊松分布置信區(qū)間（95%概率）內(nèi)，則判定合格，否則判定不合格。評價結(jié)論為5家實驗室結(jié)果合格，3家實驗室（4、7和8號實驗室）結(jié)果不合格，詳見表3。

3.3? ? 改進(jìn)的En值評價結(jié)論

按照改進(jìn)的En值評價考核結(jié)果，6家實驗室結(jié)果評價“滿意”，2家實驗室（7、8號實驗室）結(jié)果“不滿意”，詳見表4。

4? ? 問題追蹤

針對評價“不合格”或“不滿意”實驗室開展問題追蹤，查閱原始記錄和結(jié)果報告單，發(fā)現(xiàn)7、8號實驗室初發(fā)酵時為陽性的試管，進(jìn)行復(fù)發(fā)酵時，有幾支陽性試管變?yōu)殛幮?。這屬于異常情況。因為本次考核用菌株為單一的Escherichia coli NCTC 12241，該菌株在初發(fā)酵培養(yǎng)基和復(fù)發(fā)酵培養(yǎng)基中都能很好的生長，不應(yīng)該出現(xiàn)陽轉(zhuǎn)陰的情況。與實驗室操作人員溝通，最終確定為過失誤差，即復(fù)發(fā)酵接種時，接種環(huán)經(jīng)酒精燈灼燒后，未充分冷卻，導(dǎo)致接菌環(huán)上的待接菌燙死，未成活，故復(fù)發(fā)酵變成陰性。如果排除7、8號實驗室的過失誤差，按照與初發(fā)酵相同的陽性試管，得到MPN值為49，該值與泊松分布置信區(qū)間評價為“不合格”的4號實驗室相同，對4號實驗室進(jìn)行問題追蹤，未發(fā)現(xiàn)問題。而按照改進(jìn)的En值評價，這些結(jié)果應(yīng)該判定為“滿意”結(jié)果。更關(guān)鍵依據(jù)是該MPN 值的置信區(qū)間17～130，完全覆蓋考核樣品的標(biāo)準(zhǔn)值及其不確定度范圍。問題追蹤結(jié)論進(jìn)一步驗證了改進(jìn)的En值評價的可行性。

5? ? 結(jié)論

（1）結(jié)合問題追蹤結(jié)果，比較了Grubbs檢驗法、泊松分布置信區(qū)間法和改進(jìn)的En值法的評價結(jié)論，不難發(fā)現(xiàn)：將微生物偏態(tài)分布的結(jié)果進(jìn)行了對數(shù)轉(zhuǎn)換后轉(zhuǎn)變成近似正態(tài)分布，然后采用Grubbs法進(jìn)行異常值檢驗，判定了8家實驗室均“合格”，顯然評價方法識別精度不夠。泊松分布置信區(qū)間法僅僅考慮了微生物檢測結(jié)果符合泊松分布的特點，而忽略了標(biāo)準(zhǔn)定量菌株和MPN方法的不確定度。雖然MPN方法的不確定度是基于泊松分布獲得，但不同于泊松分布圖形僅由總體均值u決定，而它還與接種管數(shù)量存在反相關(guān)，即隨著接種管數(shù)量增加，置信區(qū)間變窄。例如糞大腸菌群97孔酶底物法較15管多管發(fā)酵法的置信區(qū)間要窄，97孔酶底物法MPN值33.2時，其95%置信區(qū)間為22.4～47.2，該區(qū)間是15管多管發(fā)酵法的置信區(qū)間的一半左右，因此將4號實驗室結(jié)果進(jìn)行了錯誤的判定，顯然該評價方法識別精度過嚴(yán)。而改進(jìn)的En值法不但考慮了標(biāo)準(zhǔn)定量菌株和MPN方法的不確定度，而且還考慮了其分布特點，其評價結(jié)論更符合實際情況，更加科學(xué)合理。

（2）改進(jìn)的En值保持了原有En值的優(yōu)點，通過采用En（l）和En（r）值分別評價，實現(xiàn)對糞大腸菌群（MPN法）的不確定度為不對稱分布的結(jié)果評價，評價結(jié)論仍為“滿意”和“不滿意”2種情況，當(dāng)“滿意”時，無需采取進(jìn)一步措施;當(dāng)“不滿意”時，產(chǎn)生措施信號。

（3）創(chuàng)新性地將改進(jìn)的En值評價方法應(yīng)用于微生物監(jiān)測領(lǐng)域，尚未見文獻(xiàn)報道。隨著生態(tài)環(huán)境監(jiān)測工作的不斷深入，對監(jiān)測數(shù)據(jù)質(zhì)量的要求不斷提高，標(biāo)準(zhǔn)菌株的配備、培養(yǎng)基技術(shù)驗收和定量菌株使用等質(zhì)量控制措施將不斷完善，改進(jìn)的En值不僅可以評價MPN法的能力驗證/能力考核結(jié)果，而且還可以用于日常質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度評價，符合生態(tài)環(huán)境監(jiān)測質(zhì)量管理和質(zhì)量控制科學(xué)化和精細(xì)化的要求。

（4）微生物測定結(jié)果大多屬于偏態(tài)分布，目前常見的處理方式是將測量結(jié)果轉(zhuǎn)換成對數(shù)，使其近似正態(tài)分布后，再進(jìn)行精密度或準(zhǔn)確度評價。但是，這種處理方式只是近似運算，能否客觀反映原來數(shù)據(jù)的特性，尚有一定的不確定性。

（5）MPN法的測量結(jié)果與化學(xué)分析法相比具有較寬的置信區(qū)間或不確定度，可以通過增加測定管數(shù)[6]（8管或10管）縮小其置信區(qū)間或降低其不確定度。

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收稿日期：2020-10-12

作者簡介：王寵（1979-），男，碩士，高級工程師，生態(tài)環(huán)境監(jiān)測的質(zhì)量管理和質(zhì)量控制。