鄧漢超 ，劉玉琛 ，鄧國(guó)標(biāo) ，劉 晉 ，周向陽(yáng)

(1.深圳市農(nóng)業(yè)科技促進(jìn)中心，廣東 深圳 518040；2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)作物種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(深圳)， 廣東 深圳 518040；3.深圳市作物分子設(shè)計(jì)育種研究院, 廣東 深圳 518107)

世界上第一例轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆問世以來(lái)，轉(zhuǎn)基因作物的應(yīng)用與推廣已有16載，我國(guó)每年從國(guó)外進(jìn)口大量的轉(zhuǎn)抗草甘膦CP4-EPSPS的作物和食品。隨著人們對(duì)食品及轉(zhuǎn)基因食品安全的關(guān)注，建立轉(zhuǎn)基因作物、苗、種子及其產(chǎn)品的檢測(cè)技術(shù)體系極為重要。我國(guó)目前市場(chǎng)上已經(jīng)開發(fā)出多種商業(yè)化的基于蛋白質(zhì)測(cè)定的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)試劑盒，然而由于生產(chǎn)工藝的不同，表達(dá)出的外源蛋白通過參考物質(zhì)定量的量值難以溯源到上一級(jí)的計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)，因此造成不同廠商不同試紙條測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確和缺乏可比性，為此將對(duì)轉(zhuǎn)基因的安全監(jiān)管帶來(lái)隱患，而且會(huì)引發(fā)法律、貿(mào)易糾紛等經(jīng)濟(jì)和社會(huì)問題。面對(duì)我國(guó)缺少基于統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的溯源蛋白，為此建立高效、快速、大量制備純度高的重組蛋白CP4-EPSPS技術(shù)體系尤為重要。本研究通過構(gòu)建細(xì)菌表達(dá)載體在大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)，建立大量制備高純度的重組蛋白CP4-EPSPS技術(shù)體系，可為轉(zhuǎn)基因植物、食品等蛋白檢測(cè)用抗體提供穩(wěn)定免疫性抗原，同時(shí)也可為蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制提供穩(wěn)定物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究材料

轉(zhuǎn)基因大豆種子，表達(dá)載體pet30a，E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑

T4 DNA連接酶、NdeI限制性內(nèi)切酶、XhoI酶、Taq DNA聚合酶等酶購(gòu)自TaKaRa公司、卡那霉素Kan購(gòu)自深圳市百勝科創(chuàng)生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CP4-EPSPS基因的克隆和表達(dá)載體構(gòu)建

在NCBI上獲取CP4-EPSPS基因序列(登錄號(hào)為AF464188.1)，使用Primer5軟件設(shè)計(jì)引物，上下游引物5'端分別增加NdeI和XhoI酶切位點(diǎn)，其中上游引物F為：AGATATACATATGTCTCACGGTGCAAGCAGCC，下游序列R為：GTGCTCGAGGGCAG-CCTTCGTATCGGAGA。

將大豆種子研磨成粉末，用Qiagen核酸提取試劑盒提取基因組DNA。以提取的DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸2 min；10 ℃降溫2 min。

PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，分離目的片段，采用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，回收產(chǎn)物與pet30a載體進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物通過42 ℃熱擊，轉(zhuǎn)化進(jìn)入E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，然后將轉(zhuǎn)化菌液涂于LB平板(含卡那霉素)上，37 ℃條件下培養(yǎng)過夜。挑取單克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證及測(cè)序驗(yàn)證，將正確的菌落重新接種，-80 ℃條件下保菌及提取質(zhì)粒在-20 ℃長(zhǎng)期保存。

1.2.2 目的蛋白表達(dá)與純化條件優(yōu)化

取出-80 ℃保存的菌，在冰上緩慢解凍或者取保存的質(zhì)粒進(jìn)行熱擊轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，然后接入含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃中振蕩培養(yǎng)至OD600為0.8，加入終濃度為1 mM的IPTG，在25 ℃低溫下誘導(dǎo)過夜表達(dá)。

收集菌體，超聲，離心，取上清，上樣至鎳柱，分別以15 mM、60 mM、150 mM以及300 mM咪唑洗滌，將各洗滌組分進(jìn)行電泳，選擇最優(yōu)的咪唑洗滌濃度。將最優(yōu)咪唑洗脫濃度洗滌的組分進(jìn)行10 mM Tris-HCl

(pH8.0)透析，測(cè)量濃度和純度，-20 ℃保存。

1.2.3 目的蛋白Brandford 定量分析

使用0.15 mmol/L NaCl將牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(濃度20 mg/mL)稀釋40倍使終濃度為0.5 mg/mL；進(jìn)行兩組平行樣，各取4支試管分別加入10 μL、20 μL、30 μL、40 μL稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品，然后分別加入0.15 mmol/L NaCl 190 μL、180 μL、170 μL、160 μL，另取一試管作為空白(200 μL 0.15 mmol/LNaCl)；取20 μL純化產(chǎn)物，加入180 μL 0.15 mmol/L NaCl；然后將每試管分別加入2 mL考馬斯亮藍(lán)(G-250)染液，充分振蕩混勻，室溫條件下靜置30 min；使用全波長(zhǎng)分光光度計(jì)(DU series600)分別測(cè)定A590，最終繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線以及計(jì)算樣品蛋白含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

采用本研究設(shè)計(jì)的上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物切膠純化后，以NdeI和XhoI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，同時(shí)pet30a載體也進(jìn)行雙酶切。將雙酶切后線性化的pet30a載體與雙酶切的PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接，獲得帶有CP4-EPSPS基因的質(zhì)粒載體(pBPIT-CP4-EPSPS)，其結(jié)構(gòu)如圖1。

圖1 CP4-EPSPS質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖

以通用引物進(jìn)行雙向測(cè)序(部分結(jié)果見圖2和圖3)，測(cè)序結(jié)果經(jīng)過BLAST比對(duì)，測(cè)序序列與原NCBI序列完全一致。

圖2 反向測(cè)序部分結(jié)果

圖3 正向測(cè)序部分結(jié)果

2.2 目的蛋白純化條件優(yōu)化

本研究采用鎳柱對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，分別以15 mM、60 mM、150 mM以及300 mM咪唑進(jìn)行洗滌，將4個(gè)梯度咪唑濃度洗滌的組分進(jìn)行電泳，結(jié)果見圖4。使用15 mM咪唑洗滌只能獲得極少部分的蛋白(見條帶4)，使用60 mM咪唑洗滌只能獲得極少部分目的蛋白(見條帶5)，使用300 mM咪唑進(jìn)行洗滌獲得較多的雜蛋白(見條帶7)，最優(yōu)的咪唑洗滌濃度為150 mM(見條帶6)。

圖4 CP4-EPSPS的表達(dá)和純化結(jié)果注：1. 質(zhì)粒pet30a未誘導(dǎo)全菌；2. 質(zhì)粒pet30a誘導(dǎo)后全菌；3. pBPIT-CP4-EPSPS質(zhì)粒未誘導(dǎo)全菌；4.CP4-EPSPS蛋白15mM咪唑洗滌；5.CP4-EPSPS蛋白60mM咪唑洗滌；6.CP4-EPSPS蛋白150mM咪唑洗滌；7.CP4-EPSPS蛋白300mM咪唑洗滌；M. 分子量Marker

2.3 目的蛋白的表達(dá)和定量分析

通過離心收集表達(dá)菌體，再經(jīng)過超聲破碎、離心后，分為上清和沉淀，然后使用SDS-PAGE電泳進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見圖5。由圖5可知，所表達(dá)的目的蛋白CP4-EPSPS在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)絕大部分是以可溶性方式存在于細(xì)胞上清液中(可見條帶6)，以包涵體形式存在細(xì)胞中很少(見條帶5)。使用鎳柱純化細(xì)胞上清液，最終獲得高純度的目的蛋白(可見條帶7)，將150 mM咪唑洗脫獲得的組分進(jìn)行10 mM Tris-HCl透析(可見條帶8)，該組分的電泳純度>85%，利用Brandford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度為0.9 mg/mL。

圖5 CP4-EPSPS蛋白的表達(dá)和純化結(jié)果注：1. 質(zhì)粒pet30a未誘導(dǎo)全菌；2. 質(zhì)粒pet30a誘導(dǎo)后全菌；3. pBPIT-CP4-EPSPS質(zhì)粒未誘導(dǎo)全菌；4. pBPIT-CP4-EPSPS質(zhì)粒誘導(dǎo)后全菌；5. pBPIT-CP4-EPSPS質(zhì)粒誘導(dǎo)超聲沉淀；6. pBPIT-CP4-EPSPS質(zhì)粒誘導(dǎo)超聲上清；7. CP4-EPSPS蛋白150mM咪唑洗滌；8. CP4-EPSPS蛋白透析后；9. Marker

3 討論

轉(zhuǎn)基因食品的安全性一直備受人們的關(guān)注，其安全性評(píng)價(jià)需要以轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)結(jié)果為基礎(chǔ)?；谵D(zhuǎn)基因作物、食品等的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)技術(shù)可分為兩大類：一類是基于外源核酸(DNA)成分的檢測(cè)方法[1-3]，另一類是基于外源核酸表達(dá)的外源蛋白質(zhì)通過免疫學(xué)的分析方法[4-5]。目前，基于蛋白質(zhì)的檢測(cè)技術(shù)在植保植檢、農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全、食品安全、生命科學(xué)研究、生物產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程等領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。在全球范圍內(nèi)所有已經(jīng)商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因作物中，種植和銷售最為廣泛的是含抗草甘膦CP4-EPSPS轉(zhuǎn)基因作物。我國(guó)每年進(jìn)口3000多萬(wàn)t大豆，而且年年在增加，這些大豆絕大部分來(lái)自美國(guó)和巴西轉(zhuǎn)基因大豆。因此，我國(guó)應(yīng)該盡快研究、制定和建立針對(duì)特異性蛋白質(zhì)的檢測(cè)鑒定技術(shù)體系，為我國(guó)轉(zhuǎn)基因作物及食品的安全性檢測(cè)、評(píng)價(jià)保駕護(hù)航。

本研究構(gòu)建了一個(gè)含有CP4-EPSPS外源基因的細(xì)菌表達(dá)載體并在大腸桿菌BL21菌株中的高效表達(dá)，通過SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，目的蛋白完全以可溶性方式存在于細(xì)胞破碎上清液中。收集該上清液并進(jìn)而通過鎳柱親和層析，CP4-EPSPS重組蛋白純度可達(dá)85%以上，利用Brandford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度為0.9 mg/ml。該蛋白表達(dá)和純化體系可為CP4-EPSPS轉(zhuǎn)基因植物蛋白檢測(cè)用抗體提供穩(wěn)定免疫性抗原，同時(shí)也可為蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制提供穩(wěn)定物質(zhì)基礎(chǔ)。

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