陳 崢，劉 波，朱育菁，潘志針，劉 欣，劉丹瑩

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所 350003)

青藏高原包括藏北高原、藏南谷地、柴達(dá)木盆地、祁連山地、青海高原和川藏山峽谷區(qū)等，被譽(yù)為地球“第三極”和“世界屋脊”，是地學(xué)、生物學(xué)、資源與環(huán)境等研究領(lǐng)域的重點(diǎn)地區(qū)和天然實(shí)驗(yàn)室。福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芽胞桿菌研究團(tuán)隊(duì)(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“研究團(tuán)隊(duì)”)加入由中國(guó)科學(xué)院微生物研究所組織的青藏高原聯(lián)合科考隊(duì)，在國(guó)內(nèi)首次系統(tǒng)開(kāi)展青藏高原芽胞桿菌資源的采集、分離和鑒定工作。2013-2016年研究團(tuán)隊(duì)系統(tǒng)開(kāi)展了青藏高原芽胞桿菌資源考察，收集了海拔500～5100 m的高原荒漠、峽谷、草甸、溫帶森林、亞熱帶雨林、熱帶雨林等生境下的芽胞桿菌資源，系統(tǒng)調(diào)查青藏高原極端環(huán)境條件下存活的芽胞桿菌資源情況，通過(guò)菌株分離篩選與科學(xué)鑒定，發(fā)現(xiàn)未見(jiàn)報(bào)道的新種，進(jìn)行功能開(kāi)發(fā)利用；并建立起青藏高原芽胞桿菌資源名目與資源庫(kù)，完善中國(guó)芽胞桿菌分類(lèi)體系。

研究團(tuán)隊(duì)與中國(guó)科學(xué)院微生物研究所合作開(kāi)展“青藏高原及新疆地區(qū)特色微生物資源與多樣性調(diào)查”項(xiàng)目的研究。自2013年以來(lái)，研究團(tuán)隊(duì)系統(tǒng)開(kāi)展了青藏高原地區(qū)芽胞桿菌資源采集工作，包括青藏野外科學(xué)考察芽胞桿菌資源采集、川青野外科學(xué)考察芽胞桿菌資源采集、川滇野外科學(xué)考察芽胞桿菌資源采集、青甘野外科學(xué)考察芽胞桿菌資源采集、川藏野外科學(xué)考察芽胞桿菌資源采集等。采集和分離到的青藏高原芽胞桿菌菌株保存于青藏高原芽胞桿菌資源庫(kù)，截至2017年3月共保存資源載體(主要是土壤)2827份，分離菌株8532株，其中初步鑒定菌株811株、疑似新種43個(gè)。

1 青藏高原芽胞桿菌樣品采集路線

研究團(tuán)隊(duì)于2013-2016年進(jìn)行連續(xù)4年的樣品采集，具體的采集路線及入庫(kù)樣品數(shù)歸納于表1。

1.1 2013年青藏高原芽胞桿菌資源調(diào)查與采集

設(shè)計(jì)3條采集路線，一是西藏羌塘地區(qū)，途經(jīng)納木錯(cuò)、雙湖、尼瑪、申扎、墨竹工卡、林芝等地，共采集土壤樣品268份；二是四川阿壩-青海班瑪?shù)貐^(qū)，途經(jīng)九寨溝、松潘、阿壩、斑瑪、色達(dá)、道孚、康定、瀘定等地，共采集土壤樣品263份；三是青?？煽晌骼?，途經(jīng)互助北山、尕海湖、德令哈、青海湖、可可西里等地，共收集土壤樣品384份。

1.2 2014年青藏高原芽胞桿菌資源調(diào)查與采集

設(shè)計(jì)2條采集路線，一是川滇地區(qū)，途經(jīng)洱源、麗江、香格里拉、白茫雪山、稻城、理塘、新都橋、康定等地，共采集土壤樣品509份；二是西藏林芝地區(qū)，途經(jīng)林芝、魯朗、波密、通麥、墨脫、德行、察隅等地，共采集土壤樣品131份。

1.3 2015年青藏高原芽胞桿菌資源調(diào)查與采集

設(shè)計(jì)2條采集路線，一是青甘地區(qū)，途經(jīng)互助林場(chǎng)、孟達(dá)天池、祁連山、大黑溝等地，共采集土壤樣品902份；二是西藏山南地區(qū)，途經(jīng)林芝、山南、日喀則等地，共采集土壤樣品194份。

1.4 2016年青藏高原芽胞桿菌資源調(diào)查與采集

參加川藏地區(qū)318路線采集，途經(jīng)理塘、亞丁、雅江等地，共采集土壤樣品176份。

表1 青藏高原芽胞桿菌樣品采集路線與土壤樣品數(shù)量

2 土壤樣品分布

2.1 地理分布

研究團(tuán)隊(duì)從青藏高原6個(gè)地理板塊中采集了豐富的土壤樣品，其中來(lái)自祁連山地的土壤樣品最多，為902份；其次是來(lái)自川藏山峽谷區(qū)的土壤樣品，為872份；而青海高原、藏北高原和藏南谷地的土壤樣品分別為384份、268份和325份；來(lái)自柴達(dá)木盆地的樣品最少，為76份(表2)。

2.2 海拔分布

在青藏高原采集的土壤資源中，土壤樣品的海拔分布以海拔2900～3200 m的樣品最多，為604份，占總數(shù)的21.37 %；其次為海拔3300～3600 m的樣品，為522份，占樣品總數(shù)的18.46%；極端海拔(5000～5100 m)的樣品有34份，海拔低于2200 m的樣品有153份，分別占樣品總數(shù)的1.20%和5.41%(表3)。采集生境包括：高原荒漠、高山森林灌叢、峽谷區(qū)、草甸、森林、溫帶森林、濕地、亞熱帶雨林、熱帶雨林等(圖1-4)。

表2 土壤樣品的地理分布

注：*青藏高原地理特征參考百度百科中“青藏高原”“藏北高原”“藏南谷地”“青海高原”等詞條。

3 芽胞桿菌菌株保存與信息存檔

3.1 芽胞桿菌菌株信息存檔

對(duì)所采集土壤樣品中的芽胞桿菌進(jìn)行分離和保藏，并參照劉國(guó)紅等[1]的方法，用16S rRNA進(jìn)行初步鑒定。純化后的芽胞桿菌菌株，按研究團(tuán)隊(duì)制定的條形碼格式進(jìn)行編號(hào)，而后通過(guò)微生物菌落拍照儀進(jìn)行拍照，獲得每株芽胞桿菌的菌落形態(tài)照片。其中，芽胞桿菌菌株信息(表4)包含了土樣的入庫(kù)編號(hào)、采集地點(diǎn)、生境類(lèi)型、植被類(lèi)型、經(jīng)緯度、海拔、采樣時(shí)間及采樣人等。

3.2 芽胞桿菌菌株保存

表3 青藏高原土壤樣品的海拔分布

表4 青藏高原芽胞桿菌資源主要信息

圖1 草原草甸采集生境 圖2 峽谷采集生境

圖3 樹(shù)林采集生境 圖4 湖泊采集生境

圖5 菌株超低溫冰箱保存 圖6 芽胞桿菌菌株保存

獲得菌株編號(hào)后，采用-80℃甘油冷凍法進(jìn)行保存(圖5)。甘油和保存培養(yǎng)基按1∶4的比例配好后，進(jìn)行高壓滅菌20 min(圖6)。

4 討論

青藏高原是中國(guó)最大、世界海拔最高的高原，具有獨(dú)特的地理位置和氣候條件。目前針對(duì)青藏高原微生物多樣性的研究主要集中在冰川凍土[2]、高寒草甸[3]、高原湖泊[4]等，而針對(duì)青藏高原芽胞桿菌的系統(tǒng)調(diào)查與研究，還未見(jiàn)報(bào)道。福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芽胞桿菌研究團(tuán)隊(duì)首次開(kāi)展青藏高原芽胞桿菌資源考察，構(gòu)建了青藏高原芽胞桿菌資源庫(kù)。截至2017年3月，該資源庫(kù)入庫(kù)資源載體2827份，芽胞桿菌菌株8532株。并鑒定菌株811株，發(fā)現(xiàn)疑似新種43個(gè)。該研究為進(jìn)一步系統(tǒng)查明青藏高原極端條件下存活的芽胞桿資源狀況，發(fā)現(xiàn)未見(jiàn)報(bào)道的新種，建立起青藏高原芽胞桿菌資源名目與資源庫(kù)，為完善中國(guó)芽胞桿菌分類(lèi)體系奠定了基礎(chǔ)。

[1]劉國(guó)紅,劉波,陳倩倩,等.西藏尼瑪縣鹽堿地嗜堿芽胞桿菌資源采集與鑒定[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2016,31(3):268-272.

[2]邢婷婷,劉勇勤,王寧練,等.青藏高原木孜塔格冰川、玉珠峰冰川及扎當(dāng)冰川可培養(yǎng)細(xì)菌的生理特征[J].冰川凍土,2016,38(2):528-538.

[3]于健龍,石紅霄.高寒草甸不同退化程度土壤微生物數(shù)量變化及影響因子[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2011,20(11):77-81.

[4]張紅光,李琳,趙燕,等.青藏高原不同海拔湖水中可培養(yǎng)微生物的季節(jié)性變化[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志,2013,32(3):49-55.

[5]劉波.芽胞桿菌 第一卷 中國(guó)芽胞桿菌研究進(jìn)展[M].北京：科學(xué)出版社,2015.

[6]劉波.芽胞桿菌 第二卷 芽胞桿菌分類(lèi)學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社,2016.

[7]劉波.芽胞桿菌.第三卷 芽胞桿菌生物學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社,2016.

[8]劉波,王階平,陶天申,等.芽胞桿菌屬及其近緣屬種名目錄[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2015(1):38-59.