張 媛， 張一幟， 李 寧， 王利永， 萬建青

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所， 北京 海淀 100081)

病原微生物的風(fēng)險評估工作是實驗室生物安全管理的基礎(chǔ)。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，世界衛(wèi)生組織《實驗室生物安全手冊》(2004年第3版)增加了危險度評估、重組DNA技術(shù)的安全利用、感染性物質(zhì)運輸及生物安全保障等新內(nèi)容[1]。瑞典傳染病控制所作為世界衛(wèi)生組織生物安全控制中心，2007年前就建立了一套較為系統(tǒng)而全面的實驗室生物安全評估體系[2]。美國疾控中心和國立衛(wèi)生研究院在《微生物與生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全手冊》中對風(fēng)險評估的內(nèi)容進行了要求[3]。澳大利亞、新西蘭等其他發(fā)達國家也都建立了實驗室生物安全風(fēng)險管理標準[4]。

我國實驗室生物安全工作于2004年SARS實驗室感染事件后才真正得到廣泛關(guān)注與重視，在實驗室生物安全管理中，風(fēng)險評估是保障生物安全的核心工作。風(fēng)險評估對確定生物安全防護水平、制定實驗室操作規(guī)程、編寫儀器設(shè)備操作程序和管理規(guī)定，都具有重要的指導(dǎo)作用。但截至目前，我國建立的風(fēng)險評估與控制體系中尚未涵蓋高等級病原微生物實驗室內(nèi)實驗、中試及生產(chǎn)等活動。

為了建立完善高致病性動物病原微生物實驗操作相關(guān)過程的風(fēng)險因素的識別和評估體系，課題組按照高等級生物安全實驗室風(fēng)險管理的要求，針對高致病性病原微生物的危害和生物學(xué)特性，選取世界動物衛(wèi)生組織(OIE)和我國農(nóng)業(yè)部都將其列為生物安全4級的亨德拉病毒作為高致病性病原微生物的研究對象，根據(jù)《實驗室生物安全通用要求》(GB 19489—2008) 及其他相關(guān)法律、法規(guī)和世界衛(wèi)生組織等權(quán)威機構(gòu)發(fā)布的指南，對感染性因子的特性、實驗過程中的生物安全防護、意外安全風(fēng)險等要素進行風(fēng)險評估，并提出防控措施。

1 評估對象與依據(jù)

1.1 評估對象 在四級生物安全實驗室接收、使用、處置亨德拉病毒樣本及安保相關(guān)過程中的風(fēng)險識別與控制。

1.2 評估依據(jù) 世界衛(wèi)生組織、世界動物衛(wèi)生組織、國際標準化組織、國家衛(wèi)生主管部門和行業(yè)權(quán)威機構(gòu)發(fā)布的指南、標準及教科書等[5～8]。

2 評估內(nèi)容

為了防止檢測人員在實驗過程中發(fā)生感染，必須了解感染性因子的特性，注意實驗過程中接觸感染材料的生物安全防護，明確針對意外事故應(yīng)采取的防控及應(yīng)對措施。

2.1 感染性因子的特性 亨德拉病毒屬于副黏病毒科亨德拉病毒屬。1994年和1995年在澳大利亞的馬群中暴發(fā)了由副黏病毒引起的疾病，起初稱為馬麻疹病毒，后來更名為亨德拉病毒。在澳大利亞曾經(jīng)有兩人因感染了亨德拉病毒而死亡[9～11]。果蝠是其自然宿主，感染通常發(fā)生在果蝠生育時，此時果蝠體內(nèi)病毒含量最高[12]。澳大利亞的研究結(jié)果顯示，頻繁接觸蝙蝠的人員沒有感染的跡象[13]。亨德拉病毒具體的傳播方式尚不確定。大部分臨床病例都與馬及其血液或體液的近距離接觸有關(guān)，曾在被感染動物組織中分離到亨德拉病毒。

馬感染亨德拉病毒后的臨床癥狀與非洲馬瘟、馬流感、最急性馬皰疹病毒感染等相似。病毒損傷肺和腦部，有些感染馬因病毒損傷血管，自鼻腔和口腔流出血性分泌物[14]。人感染后主要表現(xiàn)為嚴重的流感樣癥狀，出現(xiàn)咳嗽、呼吸困難等呼吸系統(tǒng)癥狀，有的出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，表現(xiàn)為腦膜炎等癥狀[15]。

由于亨德拉病毒一旦從實驗室中泄漏，其對于實驗室工作人員具有未知的風(fēng)險，對于當(dāng)?shù)氐男竽翗I(yè)也可能產(chǎn)生影響，因此在進行與亨德拉病毒相關(guān)的所有工作都必須在生物安全四級防護水平(BSL-4)下操作。一旦懷疑檢測到亨德拉病毒的存在，所有可疑樣品都必須在BSL-4實驗室中操作。我國已將亨德拉病毒列入BSL-4實驗室所從事的病原體名錄[16]。

2.2 實驗過程中的風(fēng)險識別與控制 實驗過程中的生物安全防護主要集中在個人防護用品的穿脫、樣本的接收、樣本的使用以及廢物的處置幾個環(huán)節(jié)。

2.2.1 個人防護 個人防護操作環(huán)節(jié)存在的主要風(fēng)險因素有防護服破損、防護手套漏氣、正壓防護面罩工作故障等。

個人防護用品的穿戴由2人配合共同完成，穿戴時互相整理和檢查，確保防護無漏洞，摘脫時幫助對方消毒和脫卸。發(fā)現(xiàn)外層防護服破損后應(yīng)立即停止實驗操作，使用含有效氯5 000 mg/L的消毒液對手套進行消毒，并更換手套，在第一緩沖間脫去外層沾染的隔離衣，實驗人員撤離至第二緩沖間，穿上新的防護服回到實驗室，并按規(guī)定上報情況。如果發(fā)現(xiàn)雙層防護服破損，同樣停止實驗并更換手套，如果皮膚暴露需同組人員配合用碘伏或75%乙醇進行消毒處理，然后按照程序退出實驗室并上報情況，立即將發(fā)生暴露的實驗人員送至隔離點隔離觀察。

在生物安全實驗室中使用的一次性手套，不可再次使用。手套用后進行高壓滅菌消毒，然后丟棄。工作人員在完成感染性材料實驗離開生物安全柜之前應(yīng)該脫去外層手套，放入生物安全柜內(nèi)的高壓滅菌袋中。然后更換新手套，以避免污染其他物品。如果發(fā)現(xiàn)手套破損，應(yīng)停止試驗操作，用含1%有效氯的次氯酸鈉紙巾擦拭手套并脫下后丟棄在生物安全柜中的高壓滅菌袋中，再對內(nèi)層手套進行消毒，然后戴上一層手套繼續(xù)工作。如果外層和內(nèi)層手套均發(fā)生破損，則將手套均脫下，然后用75%乙醇對暴露的手部皮膚進行消毒處理，按標準程序退出實驗室，將發(fā)生皮膚暴露的實驗人員送至隔離點隔離觀察。

當(dāng)正壓送風(fēng)裝置發(fā)出缺電報警或停止工作，應(yīng)停止實驗操作，并按標準程序退出。更換另一組實驗人員穿戴好個人防護裝備后繼續(xù)工作。

2.2.2 樣本的接收、信息核對及開啟 毒種和樣品的接收必須有上級主管部門的授權(quán)和許可，所在單位生物安全委員會對在樣品接收、開啟實驗操作環(huán)節(jié)存在的主要危險因素進行風(fēng)險評估后方可接收。接收操作中存在的主要風(fēng)險因素有樣品標識不清楚或丟失、包裝不牢固、包裝材料不足或不符合要求、操作人員不熟悉接收程序、登記的信息不足或有誤、意外失手、體積過大或過小、包裝材料損壞、表面已經(jīng)污染、個體防護不符合規(guī)定等。開啟操作中存在的主要風(fēng)險因素有容器損壞、容器體積過大或過小、難以開啟、不熟悉容器的開啟方法、未按規(guī)定的程序和地點開啟、消毒劑不敏感或失效、樣品與接收登記的不符、樣品易產(chǎn)生氣溶膠、容器內(nèi)樣品變質(zhì)產(chǎn)生正壓、意外失手等。

實驗室應(yīng)設(shè)專人負責(zé)接收，設(shè)專用冰箱或儲存地點。由專人負責(zé)并使用安全防護裝置，在BSL-4實驗室內(nèi)進行。必須填寫接收登記表。實驗室應(yīng)有樣品接收和打開樣品的程序與操作指導(dǎo)書，包括檢查標識和包裝的程序、防護要求、開啟包裝的地點、應(yīng)急措施等。

樣本的接收也應(yīng)由2人共同完成，需要檢查樣本外包裝是否符合規(guī)范，是否有破損和滲漏痕跡，對不符合要求的送檢樣本一律拒收。將樣本運送容器表面噴灑消毒液進行消毒，然后裝入密封袋，再對密封袋表面消毒。在生物安全柜中逐層打開標本包裝，同時噴灑消毒液，用鑷子取出樣本內(nèi)包裝，用相機拍攝登記的樣本信息和流行病學(xué)資料，用電腦傳送至實驗室外，由外部人員進行信息核對。

2.2.3 樣本的使用 樣本的實驗操作主要包括取樣、勻漿、超聲處理、組織研磨、離心、移液操作、病原培養(yǎng)、毒種凍干、樣品保存等環(huán)節(jié)。實驗操作過程的主要生物風(fēng)險有溢灑、刺手、產(chǎn)生氣溶膠、容器破碎、機械傷害、意外失手、設(shè)備異常、失竊等。

如果在樣本包裝中發(fā)現(xiàn)針頭或棉棒等，應(yīng)用鑷子將其放入盛有消毒液的銳器桶中；如果針頭或污染的吸頭掉落在臺面或地面，應(yīng)用消毒劑浸透的紗布覆蓋其上，然后用鑷子將其歸攏、收集并放入銳器桶中。在發(fā)生銳器刺傷、切割傷或擦傷等情況時，實驗人員立即停止工作，同行操作者及時向監(jiān)控室報告，監(jiān)控人員接報后，應(yīng)立即報告實驗室主任和上級領(lǐng)導(dǎo)，由上級領(lǐng)導(dǎo)安排聯(lián)系定點醫(yī)院，并準備好適當(dāng)?shù)慕煌üぞ摺Ｊ軅藛T脫掉最外層手套，在同行操作者的配合下用生理鹽水沖洗傷口，盡可能沖出損傷處的血液，從急救箱取出急救藥品進行包扎，在其他操作者的配合下按照規(guī)定程序退出實驗室。及時撥打120，送定點醫(yī)院急救室，告知醫(yī)生受傷的原因及可能感染亨德拉病毒，根據(jù)情況進行醫(yī)學(xué)處理，并留院觀察。住院后，和同行的操作者一起，記錄受傷原因、可能接觸的病原微生物，并保留完整的醫(yī)療記錄。

感染性液體濺灑在生物安全柜內(nèi)，用止血鉗夾取含氯消毒劑浸濕的紗布覆蓋并擦拭，重復(fù)操作一次，使用后的紗布置于生物安全柜內(nèi)的高壓滅菌袋中，并開啟紫外線燈照射30 min。如果感染性液體濺灑到地面上，用紗布覆蓋溢出物和周圍區(qū)域，從外圍向中心傾倒消毒劑進行消毒，反應(yīng)30 min，用鑷子將覆蓋物移開并再用含消毒劑的紗布將地面擦拭干凈，然后用30 g/L過氧化氫氣體對實驗室進行終末消毒。當(dāng)感染性物質(zhì)濺灑在防護服時，另一操作人員應(yīng)立即對污染人員所處區(qū)域及衣物噴灑消毒液，之后被污染人員脫掉防護服，以防止感染性物質(zhì)觸及皮膚并防止進一步擴散。將已污染的防護服裝入垃圾袋中進行高壓滅菌處理。洗澡出防護區(qū)，撤離實驗室，設(shè)立警示標記。30 min后穿好個人防護裝備，進入實驗區(qū)，處理污染區(qū)域，用含1%有效氯的次氯酸鈉噴霧器對發(fā)生污染的區(qū)域進行消毒。如果手套表面沾染了感染性液體，應(yīng)用含氯消毒劑對手套進行消毒，脫下手套并對內(nèi)層手套進行消毒，然后更換新的手套。如感染性培養(yǎng)物或標本組織液外溢到皮膚，視為很大危險，應(yīng)立即停止工作，在另一操作者的配合下，對溢灑的皮膚采用75%酒精進行消毒處理，然后用清水或肥皂水徹底沖洗。處理后安全撤離，密切觀察3周。填寫意外事故報告，并報相關(guān)負責(zé)人。眼睛濺入感染性液體，在另一操作者的配合下，用洗眼器進行沖洗，然后用生理鹽水或清水連續(xù)沖洗，注意動作不要過猛，以免損傷眼睛。在另一操作者的配合下退出實驗室，撥打120，送定點醫(yī)院留院觀察。填寫意外事故報告，并報相關(guān)負責(zé)人。

較大量感染性物質(zhì)的濺灑、跌落、離心管破裂、超聲、勻漿等會產(chǎn)生氣溶膠。確認所有防護設(shè)備完好的情況下，使用紗布或紙巾覆蓋污染的場地并吸收溢出物，噴灑含1%有效氯的次氯酸鈉消毒液，并對防護服表面噴灑消毒劑，按規(guī)定程序撤出實驗室，張貼危險標識以示禁止入內(nèi)。30 min后由另外人員穿防護服、正壓頭盔進場處理污染物。如果懷疑受到嚴重污染，則所有人員暫時撤離現(xiàn)場，30 min后另外人員穿好防護服和正壓頭盔進場，使用紗布或紙巾覆蓋污染的場地并吸收溢出物，噴灑含1%有效氯的次氯酸鈉消毒液，退出實驗室并貼出危險標識以示禁止入內(nèi)。規(guī)定時間后，穿防護服并佩戴呼吸保護裝置，將含1%有效氯的次氯酸鈉消毒液的布和紙巾及打碎的器皿用鑷子夾取玻璃碎片，放入銳器盒內(nèi)進行高壓處理。如果實驗表格或其他打印文字材料或手寫材料被污染，應(yīng)把這些材料內(nèi)容抄到另一表格上，并把原件放到盛有1%有效氯的次氯酸鈉消毒液的容器內(nèi)。在生物安全員的監(jiān)督下進行空間消毒凈化。暴露人員應(yīng)進行醫(yī)學(xué)觀察。

當(dāng)生物安全柜故障或意外停電停止工作后應(yīng)中止操作，封閉所有盛裝感染性物質(zhì)的容器，關(guān)閉生物安全柜玻璃窗。向監(jiān)控室報告情況，并報告相關(guān)負責(zé)人。然后按標準程序退出實驗室或從應(yīng)急門撤出。當(dāng)實驗室恢復(fù)工作后，排除各種安全風(fēng)險后可重新進入實驗室進行實驗操作。

當(dāng)在實驗室內(nèi)有操作人員突然暈倒時，另一名操作人員應(yīng)停止工作，并更換一副新手套，向監(jiān)控室報告，請求人員進入第二緩沖間做好準備工作，外部人員做好救助準備。將暈倒的人員扶到坐的姿勢，讓暈倒人員的背和頭靠在救護者的胸前，救護者的雙手和胳膊架在暈倒的人的腋下，在保證無障礙的情況下，將暈倒的人拖到第二緩沖間，脫掉防護眼罩、口罩，盡可能脫掉暈倒人員和自己的防護服。外邊進入人員幫助將暈倒的人搬出實驗室。

2.2.4 廢物的處置 實驗室產(chǎn)生的有潛在生物危險的廢物必須在實驗室內(nèi)消毒滅菌，無害化后方可移出實驗室。廢物處置實驗操作的主要危險因素有：設(shè)備的示值有誤、指示劑的示值有誤、滅菌設(shè)備泄漏氣體或液體、生物密封失效等。

實驗產(chǎn)生的感染性廢棄物應(yīng)放入密封袋，再放入醫(yī)療垃圾袋，扎牢袋口，置高壓滅菌裝置中121 ℃高壓滅菌20 min，高壓滅菌后在焚燒區(qū)集中焚燒處理。

3 小結(jié)

高等級生物安全實驗室是國家生物安全核心基礎(chǔ)設(shè)施之一，美國和英國等西方發(fā)達國家早在20世紀早期就分別建立了BSL-4實驗室，此后，俄羅斯、德國、法國、澳大利亞、加拿大、意大利、瑞典、荷蘭以及亞洲日本、韓國、印度和我國臺灣地區(qū)都相繼建設(shè)BSL-4實驗室并開展烈性傳染病和高危險度病原微生物的科學(xué)研究。目前如世界衛(wèi)生組織、國際標準化組織等多個國際性組織和多數(shù)發(fā)達國家均已形成了比較完整的高等級病原微生物實驗室生物安全法規(guī)標準化體系，特別是美國、加拿大、英國等歐美發(fā)達國家在病原微生物實驗室安全的法制化建設(shè)上具備豐富的經(jīng)驗。WHO制定的《實驗室生物安全手冊》分別對高等級實驗室的建設(shè)標準、認證認可，實驗室生物安全的規(guī)范化管理，實驗室個人防護裝備、關(guān)鍵設(shè)備設(shè)施等“硬件條件”和標準化操作規(guī)程(SOP)、安全監(jiān)管條例、實驗室人員制度化培訓(xùn)等“軟件措施”等做出十分明確具體的要求。此外，美國CDC/NIH《微生物和生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全手冊》(BMBL)則是結(jié)合現(xiàn)代病原微生物實驗室的特點和管理要求，對WHO《實驗室生物安全手冊》的相關(guān)內(nèi)容做進一步的細化和升華，上述分別代表國際組織和發(fā)達國家的兩類實驗室生物安全領(lǐng)域的法律法規(guī)已成為國際同行學(xué)習(xí)、借鑒和參照的“金標準”。

我國自2004年《國家高級別生物安全實驗室建設(shè)規(guī)劃》發(fā)布以來，已經(jīng)形成了高級別生物安全實驗室體系的基本框架。為進一步提高我國高級別生物安全實驗室體系的建設(shè)水平，增強生物安全科技自主創(chuàng)新能力，根據(jù)《病原微生物實驗室生物安全管理條例》、《國務(wù)院關(guān)于加強傳染病防治人員安全防護的意見》有關(guān)要求，國家發(fā)展改革委和科技部于2016年制定并印發(fā)了《高級別生物安全實驗室體系建設(shè)規(guī)劃(2016-2025年)》，提出到2025年形成布局合理、網(wǎng)絡(luò)運行的高級別生物安全實驗室國家體系的發(fā)展目標，要求完善實驗室保障條件，健全實驗室管理體系，加強對實驗室生物安全防護的質(zhì)量控制和全過程監(jiān)管，完善實驗室生物安全、菌(毒)種保藏、儲存、運輸相關(guān)規(guī)范和操作流程，落實安保設(shè)置措施，制定實驗室生物安全事故應(yīng)對和處置預(yù)案。

為了建立完善高致病性動物病原微生物實驗操作相關(guān)過程的風(fēng)險因素的識別和評估體系，課題組按照高等級生物安全實驗室風(fēng)險管理的要求，針對高致病性病原微生物的危害和生物學(xué)特性，選取世界動物衛(wèi)生組織(OIE)和我國農(nóng)業(yè)部都將其列為生物安全4級的亨德拉病毒作為高致病性病原微生物的研究對象。雖然目前國內(nèi)外暫無我國亨德拉病毒自然感染的病例報道，但亨德拉病毒的自然宿主是果蝠，中間易感宿主主要是馬，而果蝠在我國西部地區(qū)廣泛分布，我國西部某些地區(qū)(如新疆伊犁地區(qū))又恰是我國最大的馬匹飼養(yǎng)基地，因此具備了亨德拉病毒傳播的必要條件。馬匹可因帶毒果蝠分泌物污染牧草或者食用果蝠嚼過的剩余果肉而感染，人又因和馬匹的密切接觸而感染?！敖z綢之路”沿線日益廣泛的商業(yè)交流也增加了亨德拉病毒傳入的風(fēng)險，一旦出現(xiàn)亨德拉病毒感染，我國必將開展有針對性的實驗活動。但國內(nèi)尚缺乏亨德拉病毒實驗活動中的安全風(fēng)險評估資料，盲目地開展實驗活動只會加劇病毒的擴散，因此有必要根據(jù)高致病性動物病原微生物實驗操作的特殊性和實際情況，以《實驗室生物安全通用要求》(GB 19489—2008) 及其他相關(guān)法律、法規(guī)為基準，結(jié)合WHO制定的《實驗室生物安全手冊》及美國CDC/NIH《微生物和生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全手冊》(BMBL)兩項“金標準”的相關(guān)指導(dǎo)，對亨德拉病毒感染性因子的特性、實驗過程中的生物安全防護、意外安全風(fēng)險等要素進行風(fēng)險評估，并提出防控措施。

進行風(fēng)險評估主要包括鑒定感染因子的危害、鑒定微生物實驗操作過程中的危害、實驗活動人員評估、設(shè)施設(shè)備和環(huán)境評估、根據(jù)風(fēng)險評估制定防范措施、組織專業(yè)人員審查風(fēng)險評估等步驟。本次研究僅以亨德拉病毒為模型，評估了感染性因子的特性及實驗過程中的風(fēng)險識別與控制。下一步，課題組還需要對實驗室人員、實驗操作廢棄物消毒處理、實驗室安保等項目進行風(fēng)險識別與評估，并對目前全球范圍內(nèi)高等級生物安全實驗室事故進行分析，對暴露的和潛在的風(fēng)險點進行系統(tǒng)梳理，積極推進高等級實驗室生物安全風(fēng)險評估工作的開展，為撰寫風(fēng)險評估報告積累素材。