田 原,王 建,王 嬌,陳丹清,金 森,洪春暉,王華琴,顧志剛

(江蘇省常州市武進(jìn)區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心,江蘇 常州 213000)

1 抗體應(yīng)答

機(jī)體在感染PRRSV后7～9天誘導(dǎo)抗體應(yīng)答,但是這種抗體應(yīng)答能否抵御PRRSV感染還無法證明;血清中和抗體(NAbs)只在感染后期出現(xiàn),一般是感染28天后[1]。商品化的血清學(xué)試驗(yàn)主要檢測N蛋白抗體,N蛋白很早出現(xiàn),但不能中和病毒,也沒有保護(hù)作用。大量最新研究發(fā)現(xiàn),抗非結(jié)構(gòu)蛋白(Nonstructural proteins,nsps)抗體在感染早期出現(xiàn)。血清轉(zhuǎn)換試驗(yàn)結(jié)果顯示NAbs能夠傳遞被動保護(hù)。NAbs阻止PRRSV經(jīng)胎盤感染仔豬,并為母豬和胎兒提供免疫力。但這種保護(hù)建立在高滴度的NAbs基礎(chǔ)上。重要的是：即使在檢測不到NAbs的情況下,它仍能提供保護(hù),控制病毒血癥。

造成NAbs延遲的潛在機(jī)制包括以下幾個方面：a.多糖對糖蛋白(Glycoproteins,GPs)上N-連接的糖基化具有保護(hù)作用;b.中和表位的GP5上游存在免疫顯性的誘騙表位;c.病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的抗體依賴性增強(qiáng)作用;d.下文所述的先天性免疫應(yīng)答的抑制作用[2];e.原初B細(xì)胞程序化激活的抑制作用[3]。

自然感染或者疫苗免疫啟動的免疫對二次感染只能提供有限的保護(hù)。機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性的NAbs通常需要多次疫苗免疫或者重復(fù)感染病毒。NAbs對疫苗毒株具有特異性,即只對同源性毒株有效;異源性毒株感染時機(jī)體不產(chǎn)生或者只產(chǎn)生滴度很低的交叉中和抗體[4-5]。Robinson等人[6]發(fā)現(xiàn)感染過PRRSV的商品化母豬,其血清中有高滴度的NAbs,可以抵御多種(異源性)PRRSV毒株的感染。NAbs特異性表位的鑒定仍在研究之中;Lee等人[7]在滅活的雙低糖化GP5中加入佐劑研究免疫效果。這種改進(jìn)的疫苗試驗(yàn)結(jié)果顯示,用同源性病毒感染豬,其肺臟損傷減少、病毒RNA含量降低同時誘導(dǎo)產(chǎn)生更高滴度的NAbs。Trible等人[8]已經(jīng)用廣譜中和活性的方法鑒定了M蛋白上一種特殊的氨基酸。

2 抗PRRSV感染的先天性免疫應(yīng)答

先天性免疫系統(tǒng)是宿主防御病毒感染的第一道防線。它包括物理屏障,比如皮膚和黏膜;免疫細(xì)胞,如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和自然殺傷性細(xì)胞(Natural killer,NK)。宿主先天性免疫系統(tǒng)的充分激活對任何病毒的入侵都至關(guān)重要,因?yàn)樗梢宰柚共《緩?fù)制,抑制病毒入侵黏膜組織,最重要的是可以啟動有效的適應(yīng)性免疫應(yīng)答清除胞內(nèi)病原[9]。NK細(xì)胞屬于先天性免疫淋巴細(xì)胞,能夠非特異性清除機(jī)體的所有病毒感染細(xì)胞。幼齡仔豬的NK細(xì)胞為小到中型大小,缺少足夠的胞內(nèi)顆粒物質(zhì)[10];因此,盡管保育仔豬擁有更高比例的NK細(xì)胞,但是降低了NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。

感染急性豬流感后,無論是感染還是活化的肺細(xì)胞都分泌高濃度的生物活性干擾素-α(Interferon-α,IFNα)、腫瘤致死因子-α(Tumor necrosis factorα,TNFα)以及細(xì)胞因子-1(Interleukin-1,IL-1),這與臨床癥狀和病毒的有效清除同步。另一方面,大部分的豬因日齡和免疫狀態(tài)的差異會有不同程度的免疫下調(diào)和病毒清除不完全的情況,這是PRRSV感染無法誘導(dǎo)有效的先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的原因[1]。保育豬的先天性免疫系統(tǒng)發(fā)育不完全,對病毒入侵免疫系統(tǒng)的防御作用有限,因而比成年豬更易感染PRRSV。激活的先天性黏膜免疫應(yīng)答對誘導(dǎo)腸道和呼吸道感染的保護(hù)性免疫具有重要作用。然而很多豬源性病毒先后改變了宿主的先天性免疫和適應(yīng)性免疫,導(dǎo)致隱性感染。實(shí)際上,受PRRSV干擾的免疫系統(tǒng)容易繼發(fā)細(xì)菌性和豬呼吸道疾病綜合征(Porcine RespiratoryDisease Complex,PRDC)感染,從而造成嚴(yán)重的發(fā)病率。

某些PRRSV毒株的感染會嚴(yán)重抑制NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性[13]。讓人驚訝的是這種情況發(fā)生在感染后2天[14],并持續(xù)3～4周。那些感染特定毒株的豬都有NK細(xì)胞活性降低的現(xiàn)象,這些毒株包括野毒株MN184和MN 1-18-2、實(shí)驗(yàn)室改造的活疫苗毒株VR2332以及通過非腸道途徑或者鼻腔感染的MLV-PRRS;這些豬都分泌低水平的IFNα[15]。

PRRSV誘導(dǎo)的NK細(xì)胞細(xì)胞毒性降低與NK細(xì)胞的比例無關(guān)[15],理由如下：盡管NK細(xì)胞的比例在PRRSV感染幾個星期后恢復(fù)到正常水平,但NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用仍然受到抑制,這表明PRRSV改變了NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性[18]。感染期間多種細(xì)胞因子共同調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的功能,包括IFNα/β,IL-12和IL-15。盡管原初NK細(xì)胞的數(shù)量正常,但其修復(fù)的基礎(chǔ)細(xì)胞毒活性是通過STAT1途徑進(jìn)行的。

感染PRRSV的豬分泌的原始細(xì)胞因子在數(shù)量上比其他病毒少,并且具有毒株特異性。因而這種適應(yīng)性免疫的激活是被推遲和抑制的。事實(shí)上幾種重要的血清細(xì)胞因子(如 IL-8、IL-1β、IFNγ)分泌情況與病毒含量密切相關(guān),大約84%差異可以說明這一點(diǎn)[16]。PRRSV感染誘導(dǎo)機(jī)體分泌IFNα的能力很弱,IFNα在感染全程中水平都很低,野毒感染的豬都有這種情況[1]。體外試驗(yàn)表明,病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白(nsp1、2、4、11)可以下調(diào) IFNα 的刺激作用[17]?；蚪M學(xué)研究則顯示,所有PRRSV感染豬4 dpi(days post-inoculation,dpi)時血清中均能檢測到IFNα。 PHGC(PRRS Host Genetics Consortium,PHGC)21天的攻毒試驗(yàn)顯示[17],在11-14 dpi血清IFNα上調(diào)的快速消解出現(xiàn)在那些病毒含量更低的豬體內(nèi)。體外單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的激活以及低水平的IFNα共同促進(jìn)唾液酸粘附素(Sn/CD169)的表達(dá),人們普遍認(rèn)為唾液酸粘附素是巨噬細(xì)胞上的PRRSV受體。有意思的是巨噬細(xì)胞這樣微量的刺激在最初的2 dpi足以提高PRRSV感染效率20倍左右。在一項(xiàng)50頭豬的攻毒試驗(yàn)中(這些豬均在普通環(huán)境中飼養(yǎng)),IFNα在感染早期分泌量很低,這一現(xiàn)象與大部分豬在2 dpi的病毒血癥檢測結(jié)果相吻合[14]。因此,PRRSV通過干擾NK細(xì)胞的功能和IFNα的分泌改變宿主的先天性免疫以使豬發(fā)病。

感染豬的細(xì)胞因子IL-4分泌量在2 dpi比對照組減少90%以上[14]。IL-4在鼠和人類是抗體產(chǎn)生必要條件,并且是Th2免疫應(yīng)答的診斷標(biāo)記。但它不是豬體B細(xì)胞的刺激因素;事實(shí)上IL-4阻礙了抗體和IL-6的產(chǎn)生,抑制了抗原介導(dǎo)的B細(xì)胞活化[19]。在呼吸道疾病中,IL-4能夠抑制多種炎性細(xì)胞因子的活性,在調(diào)節(jié)豬肺泡巨噬細(xì)胞的炎性活性中發(fā)揮重要作用。綜上所述,IL-4在豬體中的作用與鼠和人類不同,但它在PRRSV感染早期同樣參與宿主先天性免疫的調(diào)節(jié)。

3 抗PRRSV的適應(yīng)性細(xì)胞免疫

近期的研究比較了不同毒力1型PRRSV毒株的免疫力。毒力型的Lena與其他1型PRRSV毒株(Belgium A or Lelystad=LV)相比,會導(dǎo)致更加嚴(yán)重的疾病[20]。Lena感染引起更為嚴(yán)重的病理變化,伴隨著肺部、淋巴結(jié)的IL-1α含量升高以及流入支氣管肺泡灌洗(Bronchoalveolar lavage,BAL)白細(xì)胞(嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞)的增多。感染5周與對照組相比,所有攻毒豬的BAL中CD8+T細(xì)胞的含量更高,IFNγ分泌細(xì)胞數(shù)量更多。Lena毒株感染第一周誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的IL-1β、IFNα、IL-10、IL-12、TNFα 和 IFNγ mRNA[21]。 Lena 毒株的感染引起早期嚴(yán)重的炎性反應(yīng),主要是相關(guān)的病理變化;與其他1型毒株相比,機(jī)體對組織中的病毒清除更快,極有可能是病毒毒力所致[22]。這種差異可能導(dǎo)致巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌的活性降低,進(jìn)而引起繼發(fā)性細(xì)菌感染和PRDC[23]。對于不同的PRRSV毒株,其交叉反應(yīng)強(qiáng)度因細(xì)胞毒性細(xì)胞CD8+IFNγ和CD8μFNγ+而不同。尤其在感染后,由于毒株的感染頻率和特異性IFNγ生產(chǎn)細(xì)胞的CD8表型差異,免疫反應(yīng)有明顯差異。免疫后細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)更依賴于疫苗接種或者感染狀態(tài),而不是毒株刺激的差異;從基因和蛋白水平來看,IL-10的表達(dá)量變化比TNFα相關(guān)性更大。

Xiao等人使用 IFNγ ELISPOT試驗(yàn)證明,PRRSV特異性T細(xì)胞在感染后2周就能檢測到,與感染過程中或者感染后期淋巴組織中的T細(xì)胞數(shù)量沒有顯著差異。數(shù)據(jù)顯示,主要分布于扁桃體、胸部和腹股溝淋巴結(jié)的病毒含量在持續(xù)性感染中下降3～4個log。然而,組織中病毒含量與PRRSV特異性T細(xì)胞的比例并沒有明顯聯(lián)系。在評價分泌IFNγ-的CD8+T細(xì)胞反應(yīng)時,病毒的特異性應(yīng)答較弱,出現(xiàn)時間較晚[24]。總之,PRRSV感染對淋巴組織中特異性CD8+T細(xì)胞比例的影響并未得到證明。鮮有資料表明有效的CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Cytotoxic T cells,CTLs)控制主要的PRRSV感染,病毒血癥清除后僅有抗PRRSV CTLs能被檢測到[25]。正如Loving等人指出,更多基礎(chǔ)的免疫學(xué)試劑(豬特異性單克隆抗體,主要的組織相容性復(fù)合體抗原聚合體,分類細(xì)胞系)用以解釋這些重要的問題。

病毒通過促進(jìn)免疫抑制細(xì)胞因子IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子 -β(Transforming growth factor-β,TGF-β)的分泌侵入宿主免疫系統(tǒng),這會抑制機(jī)體產(chǎn)生有效的細(xì)胞免疫。PRRSV感染引起嚴(yán)重的免疫抑制反應(yīng),導(dǎo)致Th1免疫應(yīng)答的推遲。PRRSV N蛋白的免疫調(diào)節(jié)特性導(dǎo)致Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(T-regulatory cells,Tregs)比例和IL-10表達(dá)的上調(diào)[26]。無論是活疫苗還是滅活疫苗都大幅度提高IL-10的基因表達(dá)[26];即使病毒血癥已清除,豬肺部的IL-10含量依然是升高的。Tregs的作用在慢性遷延性的HIV,丙型肝炎和乙型肝炎、EB病毒感染的確診中均有報導(dǎo)[27]。同樣地,PRRSV協(xié)同性的免疫抑制作用可能由IL-10、TGF-β和 Tregs介導(dǎo)[13,15,26)。 所有這些研究都表明PRRSV感染會干擾免疫分子的表達(dá),導(dǎo)致適應(yīng)性免疫功能減弱。

激活的的Tregs能夠抑制抗病毒免疫,并因此促進(jìn)PRRSV感染,盡管從數(shù)據(jù)上看不是很一致。FoxP3+T細(xì)胞也可能包含在內(nèi)[28,29]。B細(xì)胞和T細(xì)胞的凋亡可能是一個重要因素,但必須找到依據(jù)證實(shí)這一點(diǎn);感染高致病性PRRSV的細(xì)胞凋亡可能是一個更重要的因素[30]。評估效應(yīng)器對記憶T細(xì)胞群在抗PRRSV中的作用十分必要,這關(guān)系到后續(xù)是刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性應(yīng)答還是病理性應(yīng)答。隨著更多的細(xì)胞和免疫試劑的普及,更多深入的研究將能解釋這些復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)問題。

Th17細(xì)胞是最近發(fā)現(xiàn)的第三種輔助型CD4+T細(xì)胞亞群,以表達(dá)IL-17A和IL-17F為特征。Th17細(xì)胞對于機(jī)體抵抗黏膜及上皮部位胞外細(xì)菌及真菌的感染十分關(guān)鍵,最新的研究表明,Th17細(xì)胞應(yīng)答同樣有助于病毒的清除[31]。樹突狀細(xì)胞(Dendritic Cell,DC)受到抗原刺激后會前往附近的淋巴結(jié)并激活Th細(xì)胞。這些游動的DCs產(chǎn)生TGFβ和IL-6,它們與共刺激分子一起激活Th細(xì)胞分化,形成的 Th17細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子 IL-17和 IL-21[32]。IL-17能夠誘導(dǎo)IL-6,IL-1p以及TNFa等防御性細(xì)胞因子的表達(dá)。IL-17通過上調(diào)抗菌肽的表達(dá)可直接殺滅入侵病原菌。IL-17甚至可以通過招募淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及其他免疫細(xì)胞至細(xì)菌感染的黏膜表面。IL-17A還可通過上調(diào)抗病毒分子 MxA及OAS的mRNA水平抑制病毒增殖(比如HBV)。

張龍[31]通過制備IL-17單抗建立了豬Th17細(xì)胞的鑒定方法,并對高低致病性PRRSV毒株感染豬只外周血、肺臟、淋巴節(jié)以及脾臟中的Th17細(xì)胞的變化情況做了分析。數(shù)據(jù)表明,高致病性PRRSV毒株(JXwn06)感染可導(dǎo)致豬外周血中Th17細(xì)胞亞群的減少,引起肺臟中Th17細(xì)胞數(shù)量的下降。研究還發(fā)現(xiàn),Th17細(xì)胞亞群的比例降低與肺臟中細(xì)菌載量升高有密切的關(guān)系。一項(xiàng)對Th17細(xì)胞分化所需的細(xì)胞因子研究表明,無論是高致病性還是低致病性PRRSV毒株感染豬肺泡巨噬細(xì)胞(Porcine alveolar macrophages,PAMs),其刺激Th17細(xì)胞分化所需的IL-6、TGF-β均下降,并且高致病性毒株對PAMs表達(dá)IL-6的抑制效應(yīng)強(qiáng)于低致病性毒株。為了研究IL-17A因子對PRRSV病毒的增殖的影響,張龍用反向遺傳學(xué)技術(shù)構(gòu)建了四株表達(dá)豬源IL-17A的PRRSV嵌合病毒。結(jié)果發(fā)現(xiàn),嵌合病毒傳代后病毒滴度均有下降,用其感染細(xì)胞的上清處理MARC-145細(xì)胞,可以抑制PRRSV體外增殖,這與慢病毒表達(dá)IL-17A的抑制效應(yīng)一致。

4 展望

PRRSV是造成我國重大經(jīng)濟(jì)損失的豬病之一。該疫病難以完全控制的原因是RNA病毒的自然特性,即病毒容易發(fā)生變異同時呈現(xiàn)出基因和抗原的多樣性特征。這也表明我們對PRRS病毒的發(fā)病機(jī)理和宿主免疫認(rèn)識還不夠[18]。

雖然在PRRSV的生物學(xué)和生態(tài)學(xué)上已經(jīng)取得重大進(jìn)展,但對病毒與宿主的相互作用以及疫苗接種的復(fù)雜機(jī)制還未了解透徹,對B細(xì)胞和T細(xì)胞定向保護(hù)的關(guān)鍵免疫學(xué)指標(biāo)以及病毒蛋白在分子、細(xì)胞機(jī)制中調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)和成熟方面還知之甚少[1,3]。PRRSV持續(xù)性感染是阻礙我們控制病毒感染和傳播的重要因素,目前的診斷方法(病原)無法區(qū)分持續(xù)性感染的動物。近期對PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白的研究成果可以鑒別先天性免疫阻斷,這代表了疫苗和診斷方法開發(fā)的新方向[18]。

目前控制和消除PRRSV需要加強(qiáng)對新技術(shù)的研究,包括新型佐劑和免疫調(diào)節(jié)劑、改進(jìn)的滅活工藝、納米粒子給藥體系、新型DNA和載體導(dǎo)向的亞單位疫苗以及病毒蛋白工程和免疫細(xì)胞靶向策略[33]。理想情況下,下一代PRRS疫苗將采納其中的幾種新技術(shù),并且包含區(qū)分感染和免疫動物的標(biāo)記,能夠確定陽性免疫應(yīng)答。未來的研究需要結(jié)合基礎(chǔ)的病毒生物學(xué)和發(fā)病機(jī)理,宿主基因?qū)W以及免疫學(xué)以增進(jìn)我們對PRRS的認(rèn)識,這些將為防控策略提供科學(xué)依據(jù)。