李凡飛,何小麗,程 成,王文佳,張 凱,許立華

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院,寧夏 銀川 750021)

世界衛(wèi)生組織(Word Health Organization,WHO)已將牛結(jié)核病劃入了7大重要的人獸共患病。結(jié)核病是一種人獸共患的慢性消耗性傳染病,潛伏期較長。牛分枝桿菌(Mycobactrium bovis)是牛結(jié)核病的主要致病病原體,可以感染牛以及包括人在內(nèi)的大部分哺乳動(dòng)物[1],能夠在環(huán)境中存活數(shù)月至1年。由于動(dòng)物全球化和密集的貿(mào)易牲,結(jié)核病已經(jīng)嚴(yán)重威脅了世界公共衛(wèi)生,在2012年有大約860萬新病例產(chǎn)生和130萬例患者的死亡。近幾年,有關(guān)部門對(duì)我國牛場(chǎng)牛結(jié)核病的流行病學(xué)進(jìn)行調(diào)查,發(fā)現(xiàn)我國牛結(jié)核病的發(fā)病率一直呈現(xiàn)上升態(tài)勢(shì)。解決這一現(xiàn)象前提是要有一個(gè)在牛結(jié)核病早期就能做出準(zhǔn)確診斷的檢測(cè)方法。提純結(jié)核菌素(PPD)皮內(nèi)接種試驗(yàn)是目前具有實(shí)際意義的診斷方法,但皮內(nèi)反應(yīng)缺乏特異性,而細(xì)菌學(xué)方法又耗時(shí)過長且培養(yǎng)檢出率低、敏感性差[2];血清學(xué)診斷技術(shù)是一種快速簡(jiǎn)便的檢查技術(shù)由于結(jié)核桿菌的抗原性較弱,且屬間和種間共同抗原決定簇的存在及體液免疫與結(jié)核病的相關(guān)性未得到充分的闡明,血清學(xué)診斷技術(shù)難以取得實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展[3]。所以這些方法已無法滿足現(xiàn)代臨床診斷的需要。通過對(duì)近幾年牛分枝桿菌PCR檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展作綜述,總結(jié)出一個(gè)符合實(shí)際及合理的檢測(cè)方法。

1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)檢測(cè)技術(shù)

PCR技術(shù)是通過利用體外基因擴(kuò)增方法,將少到幾個(gè)拷貝病原微生物的DNA擴(kuò)增到常規(guī)可檢測(cè)水平,是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物技術(shù)。它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制,PCR的最大特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅增加。研究表明,結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacterium tuberculosis complex,MTBC)成員擁有一個(gè)祖先,通過連續(xù)的DNA缺失/插入得到進(jìn)化從而形成了目前的分枝桿菌?？▋?nèi)蒂分枝桿菌(M.canettii)包含所有的RD、RvD和結(jié)核病D1區(qū)域,因此可以推測(cè)它可能是最接近其基因組細(xì)菌的祖先。缺乏RD9區(qū)域的非洲分枝桿菌(M.africanum)主要存在于西非地區(qū),而該菌在東非地區(qū)則保存RD9但缺乏RD3。田鼠分支桿菌(M.microti)缺失的特異區(qū)域有RD7、RD8、RD9和RD10,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在一部分田鼠分枝桿菌中也會(huì)丟失了RD5;在西歐一些國家發(fā)現(xiàn)的牛分枝桿菌缺失(RD4～RD13)區(qū)域;山羊分枝桿菌(M.caprae)與牛分枝桿菌關(guān)系密切,但在gyrB基因上有幾個(gè)核苷酸替換。所以可以通過14個(gè)差異區(qū)(RD1～RD14)在不同菌種上有不同的缺失區(qū)域來鑒別菌株種類[4]。而PCR檢測(cè)的原理就是根據(jù)每個(gè)菌種所攜帶的基因區(qū)域各異而進(jìn)行特異性檢測(cè)。以下是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)3種常規(guī)PCR技術(shù)在牛分枝桿菌檢測(cè)中的應(yīng)用情況。

1.1 多重PCR(Multiplepolymerase chain reaction)多重PCR是在同一PCR反應(yīng)體系里有2對(duì)以上的引物,結(jié)果同時(shí)可擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR技術(shù)。Luz[5]等人于1998年通過兩個(gè)特殊基因序列pcnA和oxyR上的突變基因點(diǎn),即pcnA上169位點(diǎn)胞嘧啶(C)與鳥嘌呤(G)的不同,oxyR上285位點(diǎn)胞嘧啶(C)與胸腺嘧啶(T)的不同,利用PCR技術(shù)將牛分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌區(qū)分。劉思國等[6]于2006年也同樣根據(jù)特異的pcnA基因序列建立了牛分枝桿菌的PCR方法。他們以牛分枝桿菌培養(yǎng)陽性和陰性為參考,擴(kuò)增的陽性符合率為90%,擴(kuò)增的陰性符合率100%。PCR是一種簡(jiǎn)便、靈敏、快速(檢測(cè)時(shí)間不到3 h)、特異的基因診斷技術(shù),尤其對(duì)排菌少的機(jī)體可以做早期診斷如肺外結(jié)核的診斷具有重要意義。2012年喬宏勝[7]等構(gòu)建了以3種分枝桿菌特異性片段為目的基因的多重PCR檢測(cè)方法,3個(gè)特異序列分別為結(jié)核分枝桿菌RD10序列、牛分枝桿菌moaB序列、鳥分枝桿菌16～23S rDNA序列。該方法的最低檢出量為103copies/μL的DNA模板,可用于結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、鳥分枝桿菌的鑒別和牛結(jié)核病的快速檢測(cè)。2013年張喜悅[8]等先將臨床分離的菌株進(jìn)行篩選,即通過MYCGEN和TB1基因檢測(cè)來判斷是否為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群,再對(duì) 16S rRNA、Rv0577、IS1561、Rv3877、Rv3120 基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增,最終通過擴(kuò)增出的目的片段鑒別分離菌株的種類。2016年Zhang Quan[9]等設(shè)計(jì)出16S rRNA、Rv3873和12.7-kb基因的多重PCR。通過該方法可以鑒別出結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、?？ń槊绾头墙Y(jié)核分枝桿菌。該方法從盲樣中檢測(cè)出牛結(jié)核病數(shù)量要少于γ-干擾素(INF-γ)診斷方法的檢出量。該方法也可作為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和非分枝桿菌鑒別的補(bǔ)充試驗(yàn)。多重PCR反應(yīng)缺點(diǎn)是體系內(nèi)多條引物擴(kuò)增時(shí)會(huì)產(chǎn)生相互抑制,PCR副產(chǎn)物焦磷酸的產(chǎn)生也會(huì)抑制PCR反應(yīng)。為克服多重PCR反應(yīng)的不足,近年來新的PCR衍生技術(shù)不斷發(fā)展,如逆轉(zhuǎn)錄PCR、巢式PCR等。

1.2 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR) RT-PCR是以RNA為模板,先將RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后對(duì)cDNA進(jìn)行PCR,使RNA在體外大量擴(kuò)增。RT-PCR提供了一種基因表達(dá)、檢測(cè)、定量和cDNA克隆的快速靈敏的方法。因此,RT-PCR成為目前獲得目的RNA的一種重要手段。近年基于原核RNA半衰期短(2～3 min)將mRNA與熒光定量PCR結(jié)合,建立特異、敏感、快速、可靠的活菌檢測(cè)技術(shù),通過評(píng)價(jià)特異性、靈敏度、重復(fù)性來區(qū)分細(xì)菌存活狀態(tài)和檢測(cè)臨床樣本的能力等,為牛分枝桿菌的快速檢測(cè)提供新方法和新思路。2015年Y.choi[10]等以結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的16S rRNA作為目的基因增加了聚合酶鏈反應(yīng)的靈敏度和特異性有利于牛結(jié)核病的診斷。在痰樣本中16S rRNA逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)的靈敏度為94.6%。蔡龍等[11]用該技術(shù)檢測(cè)3株結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株在利福平、異煙肼處理24 h后85B mRNA表達(dá)水平的變化,結(jié)果顯示,本方法與絕對(duì)濃度法有一致的檢測(cè)結(jié)果。RT-PCR技術(shù)可用于快速檢測(cè)牛分枝桿菌的藥敏試驗(yàn)。但該方法的缺點(diǎn)是操作繁雜、質(zhì)量控制要求高。但隨著自動(dòng)化儀器的開發(fā)以及方法學(xué)的進(jìn)一步完善,它或?qū)⒊蔀榕７种U菌藥敏試驗(yàn)快速有效的檢測(cè)方法。

1.3 巢式PCR(Nested-Polymerase Chain Reaction,NPCR) 巢式PCR是使用兩條PCR引物擴(kuò)增完整的片段,第1對(duì)PCR引物擴(kuò)增片段和普通PCR相似,第2對(duì)是巢式引物,結(jié)合在第1次PCR產(chǎn)物內(nèi)部,使第2次PCR擴(kuò)增片段短于第1次擴(kuò)增,這種巢式PCR特異性特別高。2001年M.C.[12]等使用單管套式PCR(One-tube nested-Polymerase Chain Reaction,OTN PCR)從奶樣分離的菌樣品中篩選出牛分枝桿菌;在牛奶,這個(gè)試驗(yàn)的最低檢出量是20～50細(xì)胞/毫升。該方法在沒有牛分枝桿菌細(xì)胞的樣品中擴(kuò)增不出特異性產(chǎn)物,這表明OTN PCR具有很高的特異性,PCR外部的引物用的是牛分枝桿菌特異性蛋白質(zhì)抗原的基因。在我國,已經(jīng)有人應(yīng)用NPCR來檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌,但是,NPCR作為篩選技術(shù)或者診斷技術(shù),還需要全面提高了PCR診斷能力,由于其缺乏一個(gè)有效的程序富集分枝桿菌,而影響檢測(cè)的靈敏性。

2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR)

實(shí)時(shí)定量PCR是一種新的核酸定量技術(shù)。該方法通過在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。染料法：在PCR反應(yīng)體系中,加入過量SYBR熒光染料,SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后,發(fā)射熒光信號(hào),而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào),從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加同步,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。TaqMan探針法：探針完整時(shí),報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收;PCR擴(kuò)增時(shí),Taq酶的5′-3′外切酶活性將探針酶切降解,使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離,從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào),即每擴(kuò)增一條DNA鏈,就有一個(gè)熒光分子形成,實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物的形成完全同步。樣品處理液的實(shí)時(shí)熒光PCR為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群分離培養(yǎng)提供一個(gè)簡(jiǎn)捷的方法。實(shí)時(shí)熒光PCR能快速、精確地篩選出從患牛淋巴結(jié)上的牛分枝桿菌[13]。與“金標(biāo)準(zhǔn)”的細(xì)菌培養(yǎng)相比,傳統(tǒng)PCR檢出的陽性符合率為93%所消耗時(shí)間為9 h,而熒光定量PCR檢出的陽性符合率為71%,所消耗時(shí)間僅為30 min[12]。因此熒光定量PCR技術(shù)將來對(duì)于牛結(jié)核病可能作為高通量分子診斷技術(shù)。對(duì)于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群成員的鑒定是至關(guān)重要的,這為及時(shí)正確地進(jìn)行抗生素治療以及公共衛(wèi)生服務(wù)管理提供合理的措施。目前商用分子化驗(yàn)僅能鑒定分枝桿菌群,還無法區(qū)分結(jié)核分枝桿菌與其基因組相近的牛分枝桿菌、牛分枝桿菌卡介苗。

2008 年Benjamin A.Pinsky[14]等基于基因組缺失建立多重實(shí)時(shí)熒光PCR鑒別出結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、牛分枝桿菌卡介苗和結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的其他菌株。2014年M.L.Sales[15]等建立了兩個(gè)分別以PE-PGRS 20和RD4為目的基因的實(shí)時(shí)PCR來檢測(cè)牛分枝桿菌和以PE-PGRS 20和RD4基因?qū)崟r(shí)PCR,特異性分別為91%和100%;檢出量分別為0.32 ng和4 pg。2016年Renata Duarte[16]等建立根據(jù)設(shè)計(jì)RD4的引物的實(shí)時(shí)定量PCR試驗(yàn),該方法可以直接從奶樣和血樣直接檢測(cè)牛分枝桿菌;通過對(duì)當(dāng)?shù)啬虡雍脱獦拥臋z測(cè)便可對(duì)當(dāng)?shù)嘏＝Y(jié)核病進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查。2010年謝志勤[17]等根據(jù)結(jié)核分枝桿菌23S rRNA基因序列和牛分枝桿菌特殊基因序列,設(shè)計(jì)了2對(duì)針對(duì)結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌的特異性引物和2條用不同熒光基團(tuán)標(biāo)記的TaqMan探針,建立了結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌的二重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法,并對(duì)建立的方法進(jìn)行敏感性、特異性測(cè)定和臨床樣品檢驗(yàn)。該方法特異性好,能區(qū)分不同模板濃度組合的結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌;可檢測(cè)到10 copies模板的結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌。

由此可見,實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法具有特異、敏感、快速、可定量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn),適合用于結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌的鑒別檢測(cè)。它還有其他優(yōu)點(diǎn),如出結(jié)果更快、能定量、自動(dòng)化程度更高等。與傳統(tǒng)PCR相比在對(duì)結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)特異性方面提高許多,但由于其靈敏度高、實(shí)驗(yàn)操作易受污染等而易出現(xiàn)假陽性,因?yàn)橹灰形⒘坎≡w存在,PCR擴(kuò)增即可表現(xiàn)為陽性。所以該結(jié)果并不能作為診斷依據(jù),只有當(dāng)一定數(shù)量的病原體存在時(shí)才有臨床意義,另外檢測(cè)需要定量 PCR儀,價(jià)格昂貴不易普及。

3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplificatial,LAMP)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增是眾多核苷酸擴(kuò)增技術(shù)中的一種,自從Notomi等研究者于2000年公布該技術(shù)以來,該技術(shù)已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域,其中就包括對(duì)病原體感染的檢測(cè)。研究者稱LAMP已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域中各個(gè)方面,如DNA或RNA的特異高效的擴(kuò)增。這很大程度上要?dú)w功于其特殊的擴(kuò)增原理：其擴(kuò)增目的片段時(shí)依賴的是一種具有鏈置換特性的BstDNA聚合酶和4條能夠識(shí)別靶序列上6個(gè)特異區(qū)域的引物。靶序列的擴(kuò)增反應(yīng)需要在等溫條件下進(jìn)行約1 h。與常規(guī)PCR相比,簡(jiǎn)化樣品制備過程,消除DNA提取和LAMP擴(kuò)增最初的變性步驟從而減少酶的失活。

2010年 陳偉[18]等對(duì)臨床分離得到的PPD陽性牛的鼻拭子,陽性牛的奶樣進(jìn)行LAMP檢測(cè)時(shí),得到的陽性率遠(yuǎn)高于多重PCR檢測(cè)的數(shù)量。2016年zhang H[19]等建立了檢測(cè)和診斷早期牛結(jié)核病的鑒別診斷方法。研究者使用LAMP來檢測(cè)牛分枝桿菌,基于擴(kuò)增一個(gè)牛分枝桿菌菌株特異基因mpb70。反應(yīng)體系內(nèi)僅有7個(gè)拷貝基因,LAMP試驗(yàn)都能檢測(cè)出來;而對(duì)于傳統(tǒng)PCR,只有70拷貝基因以上才能檢測(cè)到?；趍pb70基因的LAMP方法能夠在人類或動(dòng)物上區(qū)分牛分枝桿菌和其他分枝桿菌,所以LAMP可作為牛分枝桿菌引起的牛結(jié)核病診斷的一個(gè)潛在工具。

結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群LAMP檢測(cè)方法具有高特異性和高靈敏度、操作快速簡(jiǎn)單、成本較低等特點(diǎn),所以未來在疾病診斷以及核酸檢測(cè)中將起到重要作用。相信結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群LAMP檢測(cè)技術(shù)將會(huì)廣泛應(yīng)用于牛結(jié)核病的診斷并會(huì)得到有效的大范圍推廣。LAMP的方法實(shí)際上是為了檢測(cè)人類結(jié)核病,該方法也可用于鑒別診斷牛結(jié)核病。近幾年,隨著LAMP檢測(cè)方法越來越成熟,未來會(huì)成為檢測(cè)技術(shù)中的主要方法。LAMP檢測(cè)方法具有簡(jiǎn)單快速(只需要一個(gè)水浴鍋就可以完成檢測(cè)過程)、高靈敏度、高特異性等優(yōu)點(diǎn),是上述幾種檢測(cè)方法所不能夠比擬的。

4 結(jié)語

總之,分子生物學(xué)技術(shù)作為檢測(cè)技術(shù)方面具有靈敏、特異、快速等優(yōu)點(diǎn),在牛結(jié)核病診斷技術(shù)領(lǐng)域具有巨大的發(fā)展?jié)摿ΑＤ壳皩?shí)驗(yàn)室的研究已經(jīng)取得一定的成績,現(xiàn)在正準(zhǔn)備向牛結(jié)核病現(xiàn)場(chǎng)診斷應(yīng)用過渡,而這個(gè)過程也面臨諸多問題,如在實(shí)驗(yàn)操作方面缺乏一個(gè)有效的程序富集牛分枝桿菌以及提高DNA提取濃度問題,因此需要引進(jìn)精密儀器并由受過專業(yè)培訓(xùn)的操作者,根據(jù)科學(xué)的臨床臨界值來診斷牛結(jié)核病。我國的畜牧業(yè)發(fā)展?fàn)顩r跟發(fā)達(dá)國家相比,牛場(chǎng)的實(shí)驗(yàn)室條件較差而且牛場(chǎng)一直缺乏一個(gè)早期的牛結(jié)核病診斷方法,由此造成牛場(chǎng)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。通過對(duì)上述牛結(jié)核病分子診斷技術(shù)的綜述,確定分子診斷技術(shù)會(huì)在今后牛結(jié)核病的診斷中發(fā)揮至關(guān)重要的作用,尤其LAMP診斷技術(shù)可以作為一個(gè)簡(jiǎn)單、便捷、特異、準(zhǔn)確性高的早期檢測(cè)方法,而且它的實(shí)驗(yàn)室條件簡(jiǎn)單、易操作極有可能在規(guī)?；?chǎng)中施行。但是該檢測(cè)技術(shù)還不夠成熟和完善,其在臨床上和牛場(chǎng)上的應(yīng)用還需要進(jìn)一步通過試驗(yàn)來驗(yàn)證,若此試驗(yàn)方法能在牛場(chǎng)廣泛應(yīng)用將有利于相關(guān)部門準(zhǔn)確掌握牛結(jié)核病感染情況并及時(shí)采取隔離、防控和撲滅等應(yīng)對(duì)措施,大大減少牛結(jié)核病感染進(jìn)一步蔓延和最大程度避免經(jīng)濟(jì)損失。也為中國制定根除牛結(jié)核病的方案提供可靠性依據(jù)。