王春花,靳麗穎,王思萌

(牡丹江師范學院生命科學與技術學院,黑龍江 牡丹江 157000)

非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指排除過量飲酒和其他明確的損肝因素所致的、以彌漫性肝細胞大泡性脂肪病變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征,隨著疾病發(fā)展可由單純性脂肪變性,發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis,NASH)、肝硬化、甚至肝細胞癌。隨著人們生活水平的提高,生活習慣和環(huán)境等多種因素的改變,NAFLD患病率逐年上升并呈年輕化全球化趨勢,全球NAFLD患病率為25.24%[1],在我國NAFLD已經(jīng)替代乙型肝炎成為最常見的慢性肝病[2]。NAFLD發(fā)病機制尚不十分清楚,自1998年Day[3]首先提出“二次打擊”學說之后,“二次打擊”理論逐漸用來解釋NAFLD和NASH的發(fā)病機制。學說認為“第一次打擊”主要是指肝臟脂質的積累,甘油三酯積累并不能直接引起肝臟毒性,但游離脂肪酸過度積累導致了脂肪酸β氧化增加,產(chǎn)生活性氧簇(ROS),當ROS的生成超過機體的抗氧化能力時,出現(xiàn)氧化應激,導致炎癥因子的產(chǎn)生增加,促進了細胞凋亡,對肝臟造成了“二次打擊”。另外,2008年Jou[4]又提出了“第三次打擊”的假說：脂肪變性、氧化應激和炎癥交互作用,最終導致肝細胞壞死。理想的動物模型應完全模仿人類NAFLD全部表型,包括肥胖,胰島素抵抗,肝炎,纖維化和癌變,但這種完全復制人類疾病特征的模型至今仍是空白。目前,研究者們?yōu)榱搜芯縉AFLD發(fā)病機制及開發(fā)有效藥物,構建了不同發(fā)病特點的NAFLD模型。被用于構建NAFLD模型的動物主要有大鼠、小鼠、沙鼠、家鴨、家兔與小型豬等,其中小鼠和大鼠造模最為常見。因此,本文重點圍繞大鼠與小鼠NAFLD模型的研究進展進行綜述。

1 飲食模型

主要通過飼喂高脂肪,高膽固醇和高糖高淀粉等飼料誘導大鼠,小鼠建立模型,模型表現(xiàn)為血清甘油三酯(Triglyceride,TG)、總膽固醇(Total Cholesterol,TC)、游離脂肪酸(Free Fatty Acid,FFA)和低密度脂蛋白(Low Density Lipoprotein,LDL)等水平顯著增高,肝功能酶的活性升高,丙二醛、谷胱甘肽、超氧化物歧化酶等肝臟氧化應激指標改變,肝細胞脂肪浸潤,出現(xiàn)大泡樣脂滴,偶爾可見點狀壞死或者炎癥。此類模型常被用于NAFLD發(fā)病機制的研究。

1.1 高脂飲食(High-fat diet,HFD)模型 HFD誘導的NAFLD疾病模型主要通過飼料中添加豬油等脂肪成分,增加模型動物游離脂肪酸的攝取或合成,此類模型在發(fā)病機制上與人類NAFLD最為相似。Aragno等[5]添加15%豬油和4%膽固醇飼喂大鼠15周,體重,肝指數(shù),肝臟TG,TC和FFA等水平顯著增高,肝組織出現(xiàn)脂肪變性。Ito M等[6]利用HFD飲食誘導C57BL/6J小鼠,10周表現(xiàn)肥胖,高胰島素血癥,12周出現(xiàn)葡萄糖不耐癥,19周可觀察到肝臟脂肪變性,36～50周才觀察到不明顯的纖維化。

1.2 果糖模型 果糖模型是通過飲水或飼料中添加果糖,長期適量果糖攝入可導致腸道菌群過度生長和腸滲透性增加,門靜脈內毒素濃度增加,激活Kupffer細胞而加重肝臟炎癥發(fā)生。果糖添加可促進營養(yǎng)過剩飲食模型動物肝臟纖維化,炎癥等NASH表型的發(fā)生。Mamikutty N和張程亮分別在大鼠和小鼠飲食中添加果糖,8周后模型動物體重,血清甘油三酯和血糖水平顯著升高,肝臟脂肪變性,但未發(fā)現(xiàn)NASH的病理表現(xiàn)[7-8]。Charlton M等在高脂飲食基礎上添加果糖,構成了由果糖,脂肪與膽固醇組成的飲食,簡稱為FFC飲食。FFC飲食小鼠具有明顯的NASH表型,肝臟內可見肝細胞氣球樣變和進行性的纖維化[9]。

1.3 膽堿-蛋氨酸缺乏(Choline-Methionine deficiency,MCD)模型 MCD模型是NASH的經(jīng)典動物模型之一,主要用于NASH及肝纖維化的機制及干預藥物研究。此類模型是根據(jù)氨基酸和膽堿的缺乏引起線粒體β-氧化功能不能正常工作和極低密度脂蛋白合成量減少密切相關,MCD加重了炎癥發(fā)生及促進了肝纖維化的早期發(fā)生。與其他飲食相比,MCD飲食可在短時間內誘導小鼠出現(xiàn)大泡性脂肪變性、炎癥、纖維化病變,并且病變程度更高,較好的模擬人類NASH的疾病表型。歐強等[10]利用MCD飲食分別誘導SD大鼠與C57BL/6J小鼠,8周后大小鼠模型組均出現(xiàn)嚴重肝脂肪變,不同程度肝組織炎癥,以及轉氨酶的升高,研究發(fā)現(xiàn),小鼠模型肝組織炎癥和纖維化程度均比大鼠嚴重,更適合用于構建NASH模型。

2 藥物模型

此類模型利用藥物或化合物作用,通過干擾線粒體DNA的復制、轉錄或抑制β-氧化誘發(fā)肝細胞脂肪變性,使肝細胞脂質成分的合成或攝入量增加,或者釋放和代謝的產(chǎn)物減少,使脂肪在肝細胞內的積累量增加。藥物中毒性脂肪肝模型具有造模操作簡便,時間短,發(fā)病時間快等優(yōu)點,但與人類NAFLD發(fā)病機制,病理學改變差異較大,主要用于藥效學研究。

2.1 四氯化碳(Carbon Tetrachloride,CCl4)誘發(fā)模型 CCl4是最早采用的實驗性脂肪肝模型誘導劑,常用于肝纖維化模型的構建,其機制可能與CCl4誘導CYP2E1激活及嚴重脂質過氧化反應造成肝細胞結構和功能破壞有關[11]。Letteron P等[12]報道,大鼠皮下注射CCl4,短時間內即可觀察到中央靜脈周中重度大泡性肝細胞脂肪變性,伴有炎癥及壞死,后繼出現(xiàn)纖維化,肝硬化,但并未出現(xiàn)肥胖,胰島素抵抗等 NAFLD典型特征。文獻顯示,構建NAFLD模型時CCl4不單獨使用,通常與高脂飼料聯(lián)合誘導動物,以促進高脂飼料誘導的NAFLD進程,發(fā)展為NASH與肝硬化[13]。Kubota等利用高脂飼料聯(lián)合CCl4誘導小鼠12周,轉氨酶水平顯著升高,表現(xiàn)為肝脂肪變性,炎性細胞浸潤,肝纖維化,但與對照比較,體重無明顯變化,膽固醇血糖均下降[14]。Liu Q等利用高脂飼料聯(lián)合CCl4誘導大鼠8周,造模效果相近[15]。

2.2 鏈脲霉素(Streptozotocin,STZ)誘發(fā)模型STZ是2型糖尿病模型誘導劑,可導致胰島β細胞破壞及功能受損。新生大小鼠腹腔內或皮下小劑量注射STZ,結合HFD誘導可用于NAFLD模型構建[16]。Fujii M等通過新生小鼠腹腔注射STZ,4周齡時HFD誘導構建模型,2周可觀察到單純性脂肪變性,4周肝臟出現(xiàn)炎癥與氣球樣變,4～8周觀察到進行性的纖維化發(fā)生[16]。

2.3 二乙基亞硝胺(Diethylnitrosamine,DEN)誘發(fā)模型 DEN具有較強的肝毒性,導致肝細胞DNA損傷突變從而誘發(fā)肝癌,與人類肝癌發(fā)病過程相近,常用作大小鼠肝細胞癌模型構建的誘導劑。結合飲食誘導,此模型可用于NAFLD中肝細胞癌發(fā)生發(fā)展的研究。Thompson等[17]通過一次性給21～25日齡小鼠腹腔內注射DEN,喂養(yǎng)HFD 42周,出現(xiàn)NASH表型并伴有肝細胞癌發(fā)生。Toriguchi等[18]通過一次性注射DEN結合MCD,16周后也觀察到肝細胞癌發(fā)生。

3 基因模型

2型糖尿病、動脈粥樣硬化或肝癌研究的某些特殊品系大小鼠也可用于NAFLD模型構建。這些特殊品系大小鼠可自發(fā)形成脂肪肝,病理呈現(xiàn)顯著肝臟脂肪聚集,結合飲食或某些藥物誘導,會出現(xiàn)更全面的NAFLD表型,更接近人類NAFLD疾病譜特征。但由于這些特殊品系大小鼠的突變基因在人類極少出現(xiàn),造模價格昂貴,動物死亡率較高,因此多用于特定病理機制的研究。

3.1 2 型糖尿病類模型 瘦素缺乏型ob/ob小鼠存在瘦素編碼基因的自發(fā)突變,導致瘦素水平下降,ob/ob小鼠具有嚴重糖尿病,常用于構建2型糖尿病模型。ob/ob小鼠具有過度肥胖、高胰島素血癥、高血脂癥、肝臟脂肪變性等特征,但缺乏小葉炎癥,纖維化,不可自發(fā)形成 NASH[19-20]。構建NAFLD模型時,ob/ob小鼠常飼喂特殊飲食,如高脂飲食,MCD或被某些化合物誘導如CCl4,可促進NASH的形成。Trak-Samayra等利用高能量飲食誘導ob/ob小鼠,4周后小鼠體重,膽固醇水平升高,12周甘油三酯和轉氨酶顯著升高,20周肝臟出現(xiàn)大泡樣病變并伴有炎癥發(fā)生[19-20]。瘦素抵抗型db/db小鼠或遺傳性肥胖Zuker fa/fa大鼠存在瘦素受體編碼基因突變,瘦素受體功能受損,導致瘦素抵抗,具有ob/ob小鼠相似表型,也常結合特殊飲食或藥物用于NAFLD模型構建。但由于人類瘦素缺乏很少見,并且瘦素水平與患者NAFLD的嚴重程度無明顯相關性,限制了此類模型的應用范圍。

3.2 動脈粥樣硬化類模型 載脂蛋白E缺乏型(ApoE-/-)小鼠與低密度脂蛋白受體缺乏型(Ldlr-/-)小鼠更易發(fā)生高膽固醇血癥,動脈粥樣硬化和肥胖。研究表明,ApoE-/-小鼠與Ldlr-/-小鼠結合特殊飼料構建的NAFLD模型疾病嚴重程度更大。Sinha Hikim等[21]敲除C57BL/6小鼠ApoE基因,在喂食HFD后,發(fā)現(xiàn)肝臟脂肪變性更為明顯,可表現(xiàn)為NASH,同時出現(xiàn)細胞凋亡,組織學可見肝細胞出現(xiàn)大泡性和小泡性脂肪變性。此類模型可用于研究NASH的心血管疾病發(fā)病率與代謝綜合征。

3.3 肝細胞癌類模型 PTEN,ALR,MCER基因突變小鼠常用于在NAFLD發(fā)展進程中肝癌的研究。PTEN為腫瘤抑制基因,具有NASH背景的PTEN缺乏型小鼠在74～78周可自發(fā)形成肝細胞肝癌[22]。ALR基因敲除小鼠出生后兩周就可觀察到肝細胞脂肪變性,8周可見炎癥浸潤,肝細胞壞死,52周可出現(xiàn)肝細胞癌變,發(fā)生率約為60%[23]。MCER基因突變小鼠結合高脂飲食誘導,20周可觀察到包括大泡樣病變,炎癥,纖維化在內的全面的NASH表型,52周可進一步發(fā)展為肝細胞癌[24]。

4 展望

理想的動物模型應能夠完全涵蓋人類NAFLD整個疾病譜,較好的模擬NAFLD發(fā)生發(fā)展的過程,具有復制率高,穩(wěn)定性好,造模方法簡便,價格低廉等特點。飲食模型,如高脂飼料誘導的脂肪肝模型,具有操作方法簡便,價格低廉,重復性好,死亡率低,較好的模擬了西方人高脂高膽固醇高糖的飲食習慣等優(yōu)點,成為國內外應用最多的造模方法,但此模型造模時間過長并缺乏肝纖維化等NASH表型。MCD飲食雖能誘導炎癥和進行性的纖維化發(fā)生,但此模型飼料價格昂貴并且與人類的膳食結構不同,代謝特征與人類NAFLD相反。果糖的添加較好的彌補了以上飲食模型的缺點,相比其他飲食模型,果糖結合高脂肪高膽固醇的FFC飲食較好的復制了人類NAFLD,是目前相對理想的造模方法。藥物模型與人類NAFLD發(fā)病機制,病理學改變差異較大,常需結合高脂飲食構建復合型模型,如高脂飲食聯(lián)合CCl4模型等,最大限度模擬了人類 NAFLD的復雜性,病理變化顯著,在非酒精性脂肪肝研究中占有很大優(yōu)勢,主要用于NAFLD的纖維化,硬化和肝細胞癌的研究?；蛉狈π蛣游镏饕糜跇嫿ㄆ渌７椒y以形成的表型,如肝細胞癌等,基因模型構建常需藥物或特殊飲食聯(lián)合誘導。除以上論述的模型外,腸道菌群紊亂與免疫缺陷構建模型的方法也有報道與應用。目前,雖然完全模擬NAFLD表型的完美疾病模型仍未構建成功,但研究者們利用不同造模方法建立的NAFLD大、小鼠模型,具有不同的發(fā)病機制和病理改變,為NAFLD發(fā)病機制及防治的研究提供了豐富的平臺。綜合分析以上構建的NAFLD模型特點,未來NAFLD模型的研究將以飲食模型為主,致力于尋找更多的高能量物質配伍誘導動物,優(yōu)化飲食內物質的配比,以縮短造模時間并完善大、小鼠肝纖維化等NASH表型。同時,在飲食模型的基礎上結合多種誘導方法,如結合藥物或飲食誘導的腸道菌群紊亂模型,免疫缺陷模型構建復合模型,進一步減少造模時間,提高復制率和模型的模擬程度。