王振玲,倪家敏,孫 欣,程廣宇,劉春法,岳瑞超,王 杰,廖 軼,周向梅

(1.北京農業(yè)職業(yè)學院畜牧獸醫(yī)系,北京 房山 102442;2.中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院,北京 海淀 100193)

牛結核病是許多國家牛群的主要傳染病之一,造成養(yǎng)殖業(yè)較大的經濟損失,也影響了各國之間動物產品的進出口貿易。據(jù)世界衛(wèi)生組織稱,牛結核病是一種被忽視的流行性人獸共患病,其在人類中引起的臨床癥狀與結核分枝桿菌相同,如何凈化牛結核病已經成為了一種公共衛(wèi)生問題。

自1882年Koch發(fā)現(xiàn)結核桿菌以來,人們對結核病的探索就沒有停止過,關于牛結核病的文獻報道也是層出不窮。但由于天然宿主比較昂貴,還需要專業(yè)的設施來進行實驗,大多數(shù)研究工作都是在小鼠、負鼠等易感實驗動物中進行的[1]。因為牛結核病多呈隱性感染,難以診斷;而且天然宿主對該病的反應有可能與實驗動物的反應不同,因此本試驗通過利用牛分枝桿菌致弱株人工感染實驗牛,觀察并記錄其呼吸系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的各器官的病理組織學變化,為研究牛結核病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律提供參考信息,為牛結核病的診斷提供病理依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株 本試驗所用牛分枝桿菌致弱株(NO.2)由中國農業(yè)大學國家動物海綿狀腦病實驗室保存。

1.2 實驗動物 購自某牛場3～6月的犢牛6頭,用PPD和IFN-γ釋放試驗檢測為結核病雙陰性,隔離飼養(yǎng)于圈舍。

1.3 試驗方法

1.3.1 細菌懸液的制備 將細菌接種在7H9液體培養(yǎng)基中,置于37℃的恒溫搖床中培養(yǎng)。6～8周后將菌液倍比稀釋接種于7H10固體培養(yǎng)基中進行菌落形成單位(CFU)計數(shù),然后把細菌數(shù)量為1×103CFU的菌液保存于-80℃冰箱中待用。

1.3.2 動物的分組及接種方法 將6頭犢牛分為兩組,試驗組和對照組各3頭,打好耳標。采取鼻腔接種的方法,用5 mL注射器吸取菌液依次向試驗組犢牛的鼻孔中緩慢注入菌液,每側鼻孔注入1 mL,故試驗組的感染劑量為2×103CFU。

1.3.3 大體病變的觀察 飼養(yǎng)7個月后,頸靜脈放血處死試驗組和對照組犢牛,將犢牛尸體進行剖檢。對比對照組,觀察記錄試驗組的器官或組織的大體病變。

1.3.4 病理組織學觀察 對比對照組的犢牛,將試驗組犢牛的心、肝、脾、肺、腎、淋巴結、胃、腸等器官有病變或疑似有病變的部位切取下來,放入10%福爾馬林中固定。

固定好的樣本經常規(guī)組織處理,石蠟包埋,2 μm切片,經H.E.染色后置于光學顯微鏡觀察,采集數(shù)碼圖像,記錄結果。

2 結果

2.1 剖檢病理學變化 與對照組相比,試驗組牛只普遍消瘦,皮下及各臟器脂肪較少,肺臟表面散在分布有大小不等的、粗糙的、灰白色結節(jié),其他器官沒有明顯的眼觀病理變化。

2.2 組織病理學變化

2.2.1 肺的組織病理學變化 對照組的肺組織無明顯異常,可看到正常的氣管、血管和肺泡等結構(如中插彩版圖1A);高倍鏡下可見肺泡隔由薄層結締組織構成,氣管和肺泡中很干凈,血管中有較多紅細胞聚集,可能是由于放血不良導致(如中插彩版圖1B)。與對照組相比,試驗組低倍鏡下的肺組織結構紊亂,很少看到正常的肺泡和氣管結構,肺實質被大量炎性灶所占據(jù),特別地,還可看到試驗組的肺組織中有多個壞死灶(如中插彩版圖1C);高倍鏡下可見壞死灶為明顯的肉芽腫結構：中心部分為嗜酸性的干酪樣壞死和鈣化,中間部分可見上皮樣細胞和多核巨細胞以及淋巴細胞,外圍部分為成纖維細胞和纖維細胞構成的結締組織(如中插彩版圖1D,由于肉芽腫結構過大,該圖未顯示外圍結締組織)。

2.2.2 淋巴結的組織病理學變化 對照組的淋巴結沒有明顯病變,皮質淋巴竇、淋巴小結和副皮質區(qū)界限明顯(如中插彩版圖2A);高倍鏡下可見淋巴小結中的淋巴組織較密集(如中插彩版圖2B)。試驗組淋巴結中有些淋巴小結可見到藍紫色的鈣化灶(如中插彩版圖2C)。在淋巴結組織中還可看到幾個明顯的肉芽腫結構,肉芽腫的中心部分為藍紫色的鈣化灶和粉染的干酪樣壞死灶,中間部分可見上皮樣細胞、多核巨細胞和少量淋巴細胞,外圍部分為成纖維細胞和纖維細胞構成的結締組織(如中插彩版圖2D)。另外,還可在淋巴結中發(fā)現(xiàn)少量的炎性灶(如中插彩版圖2E);在高倍鏡下可見到炎性灶中的炎性細胞多為嗜中性粒細胞、淋巴細胞、漿細胞(如中插彩版圖2F)。有些淋巴小結稀疏、空亮(如中插彩版圖2G);高倍鏡下可見淋巴小結中的淋巴細胞大量減少(如中插彩版圖2H)。

2.2.3 脾的組織病理學變化 對照組脾組織可見明顯的小梁結構,白髓與紅髓界限清晰(如中插彩版圖3A);高倍鏡下可見白髓中淋巴細胞密集分布,紅髓中有大量的血竇(如中插彩版圖3B)。試驗組脾局部可見脾小體結構消失,白髓與紅髓界限不清,還可看到出血、淤血的現(xiàn)象(如中插彩版圖3C);高倍鏡下可見淋巴細胞、巨噬細胞和紅細胞混雜在一起,沒有明顯的界限(如中插彩版圖3D)。鏡下還可見較多白髓變得稀疏、空亮,顯示其淋巴細胞大量減少,與中插彩版圖2G、2H病變相似。

3 討論

本試驗中,試驗組的感染牛的特征性病理變化是在肺臟和淋巴結中產生了特異性的肉芽腫結構,其腸道和漿膜沒有發(fā)生明顯的病變,這與牛的結核模型中的病理變化是一樣的,可能是由于試驗的感染方法是鼻腔接種的呼吸道感染方法,且攻毒劑量不是很高[2]。而在病牛的肺臟和肺門淋巴結中形成局部的炎性灶和壞死,這些病變可能是形成肉芽腫結構的前期變化;病牛的脾臟發(fā)生的淋巴細胞相關病變說明牛分枝桿菌感染會引起機體的免疫應答反應。

感染牛結核病的野生動物負鼠、鹿、獅子等一般會在肺臟中發(fā)現(xiàn)結核病灶,有時也會在腸道中發(fā)現(xiàn)結核病灶,說明其主要通過呼吸道和消化道感染牛分枝桿菌[3]。而小鼠雖然也會在脾臟、肺臟發(fā)現(xiàn)類似的結核病灶,但其在光學顯微鏡下的結構一般看不到干酪樣壞死,與牛還是有很大差異的,這也是小鼠的牛結核病模型的缺陷[4]。

不同的接種方法和不同的接種劑量都會對牛結核病的模型造成不同的病理變化,本試驗是對試驗牛進行鼻腔接種,感染劑量為2 000 CFU的致弱株,感染牛的主要病理變化是在肺和淋巴結形成特異性的肉芽腫結構,而其他器官并沒有發(fā)生明顯的病理變化。在小鼠模型中,同樣是鼻腔感染,當接種高劑量的牛分枝桿菌時小鼠發(fā)生急性死亡,當接種低劑量的牛分枝桿菌時,小鼠則不表現(xiàn)明顯的病理變化[5]。而對小鼠進行靜脈注射時,相同的劑量在鼻腔感染時小鼠很快死亡,在靜脈感染時小鼠能存活很長一段時間;試驗還測定了小鼠脾臟和肺臟的荷菌量,發(fā)現(xiàn)無論是接種方法還是接種劑量都不影響脾臟中的荷菌量,但鼻腔接種時肺臟的荷菌量呈劑量依賴的趨勢且明顯高于靜脈接種時的荷菌量[6]。在牛模型中,靜脈和皮下注射的接種量同樣要高于鼻腔和氣管的接種量,并且提出呼吸道感染才是最接近于自然感染的接種方法,有利于提高我們對牛結核病免疫應答動力學的理解[7]。這些文獻的結果與本試驗只在肺和肺門淋巴結中出現(xiàn)典型的病變而脾臟及其他器官中沒有這些病變的結果是相符的,還證明了本試驗的合理性。

牛結核病的典型病變就是形成特異性的肉芽腫結構,這是機體抵抗牛結核分枝桿菌擴散感染所作出的防御反應,然而分枝桿菌作為一種胞內寄生菌能夠存活于肉芽腫中的巨噬細胞中,那么肉芽腫的產生對于患病動物是有害的還是有利的呢?分枝桿菌感染機體時,進入機體內被巨噬細胞所吞噬,首先就是細菌與巨噬細胞的相互作用。盡管巨噬細胞擅長吞噬和破壞包括死細胞和細菌在內的生物顆粒,但分枝桿菌已經適應了嚴酷的細胞內環(huán)境,進化出了多種方式來抑制巨噬細胞的功能,使其能夠逃避巨噬細胞的殺傷作用而在其中存活和復制[8]。雖然在分枝桿菌和巨噬細胞的相互作用中,機體能夠通過促使巨噬細胞凋亡和細胞免疫應答來消滅分枝桿菌,但機體并不能清除全部的分枝桿菌,這些防御機制會使一部分分枝桿菌進入休眠狀態(tài),當免疫能力減弱時,分枝桿菌就有可能被再激活,機體就會復發(fā)結核病[9]。因此,牛結核病所形成的肉芽腫結構對機體來說是既有利也有弊的,其中的巨噬細胞與牛結核分枝桿菌的相互作用機制對于研究結核病的新的治療干預方法以及增強疫苗功效具有非常重要的參考價值。