郭曉桐,孟 迪,霍彩云,唐玉玲,楊光輝,吳宏平,田海燕,胡艷欣

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,北京 海淀 100193)

A型流感病毒感染可導(dǎo)致人類和動物的急性上呼吸道感染,病毒的快速傳播以及較高的發(fā)病率和致死率給公共衛(wèi)生造成了巨大的威脅。流感病毒表面的糖蛋白血凝素(HA)與宿主細(xì)胞表面的糖鏈?zhǔn)荏w唾液酸(SA)的特異性結(jié)合是流感病毒感染宿主、進(jìn)而復(fù)制并繼續(xù)傳播的第一步。唾液酸受體的種類和分布對于流感病毒的宿主范圍和致病性起到重要的決定性作用,不同的宿主、不同的器官、不同的細(xì)胞表達(dá)的受體不盡相同[1]?？梢?對不同細(xì)胞表面唾液酸受體類型進(jìn)行檢測分析,可以確定細(xì)胞對何種流感病毒易感,進(jìn)而揭示病毒入侵細(xì)胞的分子機(jī)制。

肥大細(xì)胞從古老的前哨細(xì)胞進(jìn)化而來[2]。本研究的主要目的是檢測分析小鼠和大鼠皮膚、腹腔、肺臟原代肥大細(xì)胞表面唾液酸受體的表達(dá)情況,確定肥大細(xì)胞是否對流感病毒具有易感性,為進(jìn)一步揭示流感病毒入侵肥大細(xì)胞的分子機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 2～6月齡BALB/c小鼠(體重為20～30 g,雌雄均可),3～6月齡SD大鼠(體重為150～200 g,雌雄均可),均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑 熒光素標(biāo)記植物凝集素(Fluorescein-Sambucus nigrabark lectin(FL-1301)、Fluorescein-Maackia amurensislectinⅠ(FL-1311))：Vector Laboratories產(chǎn)品;兔源類胰蛋白酶抗體(Anti-Mast cell Tryptase antibody[EPR8476],ab134932)、山羊抗兔二抗(Goat anti-Rabbit IgG-H&L(Texas Red?),ab6719)：Abcam 產(chǎn)品;胎牛血清(FBS)：HyClone產(chǎn)品;PBS(磷酸鹽緩沖液,pH值7.4)、Hank′s液：北京邁晨科技有限公司產(chǎn)品;神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase)：New England BioLabs產(chǎn)品;多聚賴氨酸、BSA、Triton X-100、Tween-20、膠原酶、透明質(zhì)酸酶、HEPES、Percoll原液：Sigma-Aldrich產(chǎn)品;DAPI：R&D Systems產(chǎn)品;抗熒光淬滅劑：Southern Biotech產(chǎn)品;甲苯胺藍(lán)、配制Tyrode液和消化液的其他組成成分：北京化學(xué)試劑廠產(chǎn)品。

1.3 小鼠和大鼠皮膚肥大細(xì)胞的分離 動物經(jīng)乙醚麻醉后,放血處死,取腹部皮膚切成皮片,分離除去皮下脂肪,用改良的Tyrode液清洗皮片,將皮片剪切成1 mm2大小的小塊,放入無菌三角瓶中。經(jīng)消化液消化、培養(yǎng)箱孵育等以后得肥大細(xì)胞,經(jīng)純化和鑒定后,用預(yù)熱的培養(yǎng)液懸浮肥大細(xì)胞。

1.4 小鼠和大鼠腹腔肥大細(xì)胞的分離 動物經(jīng)乙醚麻醉后,放血處死,剪開腹部皮膚,暴露腹部肌肉,注射器注入10～30 mL預(yù)冷的無Ca2+的Tyrode液,輕輕按摩腹部5 min,注意針頭不要刮破腹腔內(nèi)的臟器,注射器頭向下再次插入腹腔,小心將灌洗液吸出,重復(fù)1次。將所收集的灌洗液置于50 mL無菌離心管中,4℃條件下800 r/min離心5 min,用預(yù)冷的無Ca2+的Tyrode液懸浮沉淀細(xì)胞。經(jīng)純化和鑒定后,用預(yù)熱的培養(yǎng)液懸浮肥大細(xì)胞。

1.5 小鼠和大鼠肺臟肥大細(xì)胞的分離 動物經(jīng)乙醚麻醉后,放血處死,在無菌條件下,取出正常肺組織10～40 g,立即放入預(yù)冷至4°C的TEA液中,在1～2 h內(nèi)使用。剔除肺組織中較大的支氣管和血管,將肺組織切成0.2～1 g的小塊,用TEA液洗2次,經(jīng)消化液消化、過濾組織塊后用HACM液懸浮細(xì)胞。經(jīng)純化和鑒定后,用預(yù)熱的培養(yǎng)液懸浮肥大細(xì)胞。

1.6 小鼠和大鼠原代分離肥大細(xì)胞的純化 使用Percoll細(xì)胞分離液對分離的原代肥大細(xì)胞進(jìn)行純化。離心后棄去上清液,用1.5 mL的Tyrode液重懸細(xì)胞,然后將細(xì)胞懸液與7 mL的等滲Percoll液混合,將1 mL的Tyrode液鋪于8.5 mL的混合物上,500 r/min離心20 min,小心吸取上面的5 mL液體棄去(其中有大量的淋巴細(xì)胞和其他的非肥大細(xì)胞)。用 Tyrode液清洗細(xì)胞 3次,4℃條件下200 r/min離心10 min。

1.7 小鼠和大鼠原代分離肥大細(xì)胞的染色鑒定 使用甲苯胺藍(lán)染色法對分離的原代肥大細(xì)胞進(jìn)行鑒定。將10 μL的1%甲苯胺藍(lán)染色液滴于10 μL的細(xì)胞懸液中,室溫染色10 min。涂片,鏡下觀察,肥大細(xì)胞胞質(zhì)中的顆粒被染成紫紅色,細(xì)胞核為淺藍(lán)色。

1.8 細(xì)胞爬片的制備 蓋玻片經(jīng)處理后浸泡于多聚賴氨酸工作液中,室溫孵育10 min后取出,在超凈工作臺中展開晾干。胰酶消化細(xì)胞后,加入完全培養(yǎng)基充分吹打,使之形成單細(xì)胞懸液。將處理好的蓋玻片小心放入細(xì)胞培養(yǎng)板中,根據(jù)需要選擇合適的細(xì)胞密度接種單細(xì)胞懸液。為防止加入細(xì)胞懸液時(shí)蓋玻片漂起,可先在細(xì)胞培養(yǎng)板中滴加少量培養(yǎng)基,然后再放入蓋玻片。整個(gè)過程注意無菌操作。

1.9 細(xì)胞爬片的免疫熒光檢測 去除細(xì)胞培養(yǎng)基,經(jīng)固定、透化、封閉后進(jìn)行免疫熒光染色：如為直接免疫熒光染色,則直接加入帶熒光標(biāo)記的抗體,室溫下孵育2～6 h;如為間接免疫熒光染色,則先加入一抗,室溫下孵育2～6 h或4℃過夜,然后加入相對應(yīng)的熒光標(biāo)記二抗,室溫下避光孵育45～60 min。用DAPI染核,隨后封片在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.10 神經(jīng)氨酸酶作用試驗(yàn) 棄去細(xì)胞培養(yǎng)基,用預(yù)熱的DMEM洗3遍。加入稀釋好的神經(jīng)氨酸酶溶液,37°C、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育3 h。預(yù)熱的DMEM洗3遍后,根據(jù)需要進(jìn)行細(xì)胞感染或其他試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠和大鼠原代肥大細(xì)胞的分離和鑒定 經(jīng)分離、純化、鑒定后的小鼠和大鼠皮膚、腹腔和肺臟的原代肥大細(xì)胞,在光學(xué)顯微鏡下觀察并比較肥大細(xì)胞的形態(tài)、數(shù)量和純度。如中插彩版圖1、圖2所示,甲苯胺藍(lán)將肥大細(xì)胞胞質(zhì)中的顆粒染成紫紅色,細(xì)胞核染成藍(lán)色,細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,大鼠原代分離的肥大細(xì)胞直徑均大于小鼠,經(jīng)Percoll細(xì)胞分離液純化后肥大細(xì)胞的純度均可達(dá)90%以上。使用Percoll細(xì)胞分離液純化前,經(jīng)皮膚制備的細(xì)胞懸液中含有大量的被毛、皮膚等雜質(zhì),此外還含有大量的成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等,細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果表明,肥大細(xì)胞占有核細(xì)胞總數(shù)的3% ～5%,大鼠每克皮膚能收獲(6.6～8.6)×105個(gè)肥大細(xì)胞,小鼠數(shù)量略少。純化前腹腔制備的細(xì)胞懸液中則主要為單核/巨噬細(xì)胞,肥大細(xì)胞所占的比例為5% ～10%,大鼠腹腔分離的細(xì)胞數(shù)有(10～20)×106個(gè)/只,其中肥大細(xì)胞為(0.4～2)×106個(gè)/只,小鼠腹腔分離的細(xì)胞數(shù)有(1～3)×106個(gè)/只,其中肥大細(xì)胞為(3～6)×105個(gè)/只。肺臟分離得到的肥大細(xì)胞數(shù)量明顯低于皮膚和腹腔,肥大細(xì)胞所占的比例僅為1%左右。

2.2 肥大細(xì)胞表面唾液酸受體表達(dá)的檢測 小鼠腹腔和肺臟分離的原代肥大細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果如中插彩版圖3所示,SNA-FITC和MAA-FITC染色均呈陽性(綠色),類胰蛋白酶染色陽性(紅色)進(jìn)一步確定了我們分離到的原代細(xì)胞為肥大細(xì)胞。經(jīng)神經(jīng)氨酸酶處理后SNA-FITC和MAA-FITC染色均呈陰性(左下角插入的小圖),確定了唾液酸受體染色的特異性。上述結(jié)果表明,小鼠腹腔和肺臟分離得到的原代肥大細(xì)胞均同時(shí)表達(dá)SAα2,6 Gal和SAα2,3 Gal,即同時(shí)表達(dá)人流感病毒和禽流感病毒受體。

大鼠腹腔和肺臟分離的原代肥大細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果如中插彩版圖4所示,與小鼠相比大鼠分離的原代肥大細(xì)胞直徑更大,因此表面唾液酸受體染色結(jié)果更加明顯,與小鼠結(jié)果相同,大鼠腹腔和肺臟分離得到的原代肥大細(xì)胞也同時(shí)表達(dá)SAα2,6 Gal和SAα2,3 Gal,即同時(shí)表達(dá)人流感病毒和禽流感病毒受體。

3 討論

試驗(yàn)表明,小鼠、大鼠腹腔和肺臟原代肥大細(xì)胞表面同時(shí)表達(dá)SAα2,3 Gal和SAα2,6 Gal,即同時(shí)表達(dá)禽流感病毒受體和人流感病毒受體。

3.1 原代肥大細(xì)胞的分離、純化和鑒定方法 為了更準(zhǔn)確的分析肥大細(xì)胞表面唾液酸受體的表達(dá)情況,使分析結(jié)果更接近體內(nèi)情況,本研究首先建立了小鼠和大鼠皮膚、腹腔、肺臟原代肥大細(xì)胞的分離、純化、鑒定方法。在原代肥大細(xì)胞的分離中我們使用了臺氏液,其屬于平衡鹽溶液的一種,具有維持滲透壓、控制酸堿平衡、供給細(xì)胞生存代謝所必須的能量和無機(jī)鹽成分等作用,為體外分離細(xì)胞的生存及代謝維持提供基本保障。在小鼠和大鼠皮膚的原代肥大細(xì)胞分離中使用的為緩沖能力更強(qiáng)的改良的臺氏液[3],制備的混合細(xì)胞懸液中除含有成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞雜質(zhì)外,還含有大量的被毛、皮膚等雜質(zhì),肥大細(xì)胞在收獲的有核細(xì)胞中占3%～5%。在小鼠和大鼠腹腔的原代肥大細(xì)胞分離中使用的為無Ca2+的臺氏液[4-5],其更能促使肥大細(xì)胞從組織中脫落,腹腔分離得到的肥大細(xì)胞數(shù)目更多、純度更高,制備的混合細(xì)胞懸液中雜質(zhì)細(xì)胞主要為單核/巨噬細(xì)胞,肥大細(xì)胞占的比例為5%～10%。小鼠和大鼠肺臟中肥大細(xì)胞含量本身較低,故分離得到的肥大細(xì)胞含量最低,肥大細(xì)胞所占的比例僅為1%左右。肥大細(xì)胞粘附性較差,制備的混合細(xì)胞懸液培養(yǎng)一段時(shí)間后,輕輕將培養(yǎng)基吸出,即可去除貼壁的其他細(xì)胞,在對肥大細(xì)胞純度要求不高時(shí),可達(dá)到純化肥大細(xì)胞的目的[3-4,6]。而當(dāng)對肥大細(xì)胞純度要求較高時(shí),純化肥大細(xì)胞主要有兩種方法,一是流式細(xì)胞術(shù)分選,二是密度離心法,肥大細(xì)胞密度在1.09 g/mL與1.17 g/mL之間[7]。本研究中考慮到成本和方便問題,小鼠和大鼠原代肥大細(xì)胞的純化采用的為Percoll密度離心法。甲苯胺藍(lán)染色能與肥大細(xì)胞中的肝素結(jié)合成特異性紫紅色,故可用于肥大細(xì)胞的鑒定[8]。

3.2 肥大細(xì)胞表面同時(shí)表達(dá)SAα2,3Gal和SAα2,6Gal兩種流感病毒受體 流感病毒通過與宿主細(xì)胞表面唾液酸受體的結(jié)合來起始感染和復(fù)制。目前被普遍接受的流感病毒受體主要有兩種,唾液酸α2,3半乳糖(Galactose,Gal)(SAα2,3 Gal)和唾液酸α2,6半乳糖(SAα2,6 Gal)。一般認(rèn)為,人流感病毒主要識別末端為α2,6 Gal的糖鏈?zhǔn)荏w,其主要存在于人類的上呼吸道,而禽流感病毒主要識別末端為α2,3 Gal的糖鏈?zhǔn)荏w,其廣泛存在于人類的下呼吸道及禽類的胃腸道[9]。除此之外,不同種類的細(xì)胞表達(dá)的唾液酸受體也有所不同,例如,纖毛細(xì)胞表面主要表達(dá)SAα2,3 Gal,而非纖毛細(xì)胞則主要表達(dá)SAα2,6 Gal[10]。目前國際上普遍采用植物凝集素對唾液酸受體糖鏈位點(diǎn)的特異性進(jìn)行識別檢測：Maackia amurensis agglutinin(MAA)可特異性識別SAα2,3 Gal,作為禽流感病毒受體的標(biāo)志;Sambucus nigra agglutinin(SNA)可特異性識別SAα2,6 Gal,作為人流感病毒受體的標(biāo)志[11]。本研究通過植物凝集素免疫熒光染色的方法對肥大細(xì)胞表面唾液酸受體的表達(dá)情況進(jìn)行定性檢測,首次發(fā)現(xiàn),小鼠、大鼠腹腔和肺臟原代肥大細(xì)胞同時(shí)表達(dá)SAα2,3 Gal和 SAα2,6 Gal兩種受體,即同時(shí)表達(dá)禽流感病毒受體和人流感病毒受體,為禽流感病毒和人流感病毒的吸附、結(jié)合提供了基礎(chǔ),據(jù)此我們推測肥大細(xì)胞可能既可以被人流感病毒感染又可以被禽流感病毒感染。