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(中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所， 吉林 長春 130112)

吉林延齡草(TrilliumkamtschaticumPall.ex Pursh)為百合科延齡草屬植物，《中華本草》稱為“頭頂一顆珠”，以干燥根莖入藥，分布于亞洲東北部地區(qū)，中國主要分布吉林。其根莖含有甾體皂甙、偏諾皂苷、延齡草皂苷、薯蕷皂苷、克里托皂苷、甾酮皂苷、倍半萜苷等多種有效成分[1-3]，具有、止痛、活血、止血功效，是治療高血壓、眩暈頭痛、神經(jīng)衰弱、腰腿疼痛、跌打損傷、月經(jīng)不調、外傷出血等癥的名貴藥材[4]。近年來，由于森林過度砍伐、生長環(huán)境破壞、過量采挖等因素, 使吉林延齡草分布范圍日趨縮小，加之種子難以萌發(fā)、成苗困難，致使種群數(shù)量逐漸減少，已被國家列為三級重點保護野生植物。因此開展吉林延齡草人工栽培將成為保護現(xiàn)有野生資源，實現(xiàn)資源可持續(xù)性利用的有效途徑。然而，吉林延齡草種子存在深度休眠現(xiàn)象[5]，這也成為制約吉林延齡草種植業(yè)發(fā)展的瓶頸。

種子休眠是指具有生活力的完整種子在適宜的條件下仍不萌發(fā)的現(xiàn)象，Kentzen指出，抑制物質的存在是植物種子休眠的主要原因之一[6]，多年來，相關學者對休眠種子中存在抑制物質研究報道較多，Paul等研究表明，火炬松休眠種子中含有高濃度抑制物質，萌發(fā)的種子中抑制物質未被檢測到[7]，Welbaum等[8]和Amritphale等[9]指出，葫蘆科(Cucurbitaceae)種子外胚乳中存在的抑制物質ABA能夠通過抑制β-1,3-葡聚糖酶的表達影響外胚乳中內含物的代謝，從而抑制珠孔端胚乳的降解與破裂，延緩種子的萌發(fā)。盡管藥用植物種子休眠機理方面的研究工作起步較晚,但在發(fā)芽抑制物質的研究方面還是取得了一定的進展。到目前為止,發(fā)現(xiàn)種子中含有抑制物質的藥用植物有人參，西洋參，刺五加，黃精等數(shù)十種[10-13]，然而關于吉林延齡草種子內源抑制物質方面的研究，尚未見報道。為此，對吉林延齡草種子內源抑制物質活性及內源抑制物質去除方法進行初步研究，為深入研究吉林延齡草種子內源抑制物質與種子休眠的關系及進一步分離、鑒定其種子中的抑制物質以及更有針對性的采取有效措施打破種子休眠，促進種子萌發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

2013年8月在吉林省敦化市采集野生吉林延齡草種子；白菜種子(秋寶，黑龍江省伊春市春禾種業(yè)有限責任公司)；水稻種子(吉農(nóng)大39，吉林農(nóng)大科茂種業(yè)有限責任公司)。乙酸乙酯和甲醇(分析純，北京化工廠)。

1.2 吉林延齡草種子浸提物制備

取自然干燥的吉林延齡草種子(含水量為6.46%)2 g，共取4份，加入研缽研碎后，移入100 mL三角瓶中，其中3份分別加入25 mL乙酸乙酯、甲醇、蒸餾水，用封口膜密封瓶口，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中浸泡24 h，超聲波提取30 min，提取液過濾后，殘渣按上述方法再浸提2次，合并全部浸提液，用旋轉蒸發(fā)儀40 ℃減壓濃縮，最終定容50 mL，乙酸乙酯提取液Ⅰ(A),甲醇提取液Ⅰ(B)，水提取液Ⅰ(C)；另1份種子粉末按上述方法先加入乙酸乙酯提取3次后，得到乙酸乙酯提取液Ⅱ(與A溶液一致)，將殘渣置于通風處，待殘渣中乙酸乙酯揮干后，按上述方法加入甲醇提取3次，得到甲醇提取液Ⅱ(D)，減壓濃縮后定容50 mL，用甲醇提取后的殘渣，按照同樣方法，得到水提液Ⅱ(E)，減壓濃縮后定容50 mL，得到質量濃度為0.04 g/mL的種子提取液A、B、C、D、E，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 吉林延齡草種子浸提物抑制活性測定

經(jīng)預試驗，取上述0.04 g/mL吉林延齡草種子浸提液A、B、C、D、E，配制成質量濃度為0.001，0.002，0.004，0.006，0.008 g/mL的溶液，各取5.0 mL種子浸提液至事先滅菌的直徑11 cm培養(yǎng)皿 (鋪有2層濾紙) 中，待有機溶劑揮干后(種子水提液C、E除外)，每皿加入5 mL蒸餾水，對照組每皿加入5.0 mL蒸餾水(加入化學試劑揮干后的處理與蒸餾水對照組無顯著性差異(p>0.05)，數(shù)據(jù)未顯示)，白菜種子每皿放100粒，水稻種子每皿放50粒，25 ℃恒溫箱培養(yǎng)，培養(yǎng)表示達到1%的顯著水平。下同。

表1 吉林延齡草種子浸提物對白菜幼苗生長的影響

質量濃度(10-3g/mL)浸提液根長(mm)抑制活性(%)胚軸長(mm)抑制活性(%)1ck19.39±1.91Aa09.13±1.21Aa0A20.03±1.83Aa-3.309.06±1.32Aa0.77B9.05±1.52Cc53.337.46±1.30Bb18.29C7.52±0.96Dd61.227.48±1.43Bb18.07D8.97±1.32Cc53.747.41±1.36Bb18.84E17.03±2.20Bb12.178.85±1.35Aa3.072ck19.39±1.91Aa09.13±1.21Aa0A19.03±1.42Aa1.869.11±1.29Aa0.22B6.34±0.96Cc67.306.11±1.33Bb33.08C4.44±0.94Dd77.104.51±1.15Cc50.60D6.53±1.12Cc66.326.05±1.23Bb33.73E11.09±1.50Bb42.818.40±1.18Aa8.004ck19.39±1.91Aa09.13±1.21Aa0A19.56±1.74Aa-0.888.96±1.18Aa1.86B4.46±0.37Cc77.003.82±0.51Cc58.16C2.74±0.41Dd85.872.32±0.44Dd74.59D4.28±0.45Cc77.933.75±0.63Cc58.93E6.94±1.18Bb64.218.16±1.30Bb10.626ck19.39±1.91Aa09.13±1.21Aa0A19.11±2.01Aa1.448.83±1.24Aa3.29B3.49±0.70Cc82.003.02±0.76Cc66.92C2.48±0.42Dc87.211.80±0.35Dd80.28D3.38±0.57Cc82.573.21±0.78Cc64.84E5.17±0.80Bb73.346.98±1.36Bb23.558ck19.39±1.91Aa09.13±1.21Aa0A19.63±1.86Aa-1.249.03±1.35Aa1.10B2.45±0.48Cc87.361.52±0.28Cc83.35C2.32±0.47Cc88.041.47±0.36Cc83.72D2.42±0.45Cc87.521.68±0.36Cc81.60E5.00±0.74Bb74.216.62±0.98Bb27.49

注：根長/胚軸長=mean±SD(n=3)，處理間不同小寫字母表示達到5%的顯著水平,不同大寫字母

72 h后采用數(shù)顯游標卡尺測定白菜種子根長及胚軸長，培養(yǎng)96 h后測水稻種子根長，每個處理重復3次。

1.4 溫水浸種去除吉林延齡草種子內源抑制物質的測定

取自然干燥的吉林延齡草種子(含水量為6.46%)0.4 g，放入100 mL三角瓶中，加入50 mL 蒸餾水，瓶口用封口膜封嚴，置于25，35 ℃和 45 ℃恒溫水浴條件下浸提，分別于提取的第 1，2，3，…14天抽取浸提液，每次抽取浸提液后，重新加入 50 mL 蒸餾水，繼續(xù)浸提。14 d后，采用白菜種子做種子浸提液的生物活性測定，各取5.0 mL種子浸提液至事先滅菌的直徑11 cm培養(yǎng)皿 (鋪有2層濾紙) 中，對照組每皿加入5.0 mL蒸餾水，白菜種子每皿放100粒，25 ℃恒溫箱培養(yǎng)，72 h后采用數(shù)顯游標卡尺測定白菜種子根長及胚軸長，每個處理重復3次。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用SAS系統(tǒng)6.12對數(shù)據(jù)進行單因素方差統(tǒng)計分析，不同處理組間的差異顯著性用Fisher’s LSD(least significant difference)法分析。抑制物質活性參照Huang等[14]的方法，抑制活性=(1-處理組)/對照組。

2 結果與分析

2.1 吉林延齡草種子浸提物對白菜幼苗生長的影響

設置種子浸提物質量濃度為0.001，0.002，0.004，0.006，0.008 g/mL，分別測定不同試劑提取、不同濃度粗提物對白菜幼根及胚軸生長的影響。由表 1可見，吉林延齡草種子浸提液(乙酸乙酯提取液除外)對白菜幼根及胚軸生長均有顯著抑制作用，說明吉林延齡草種子中存在著活性較強的內源抑制物質，且抑制物質的活性隨著粗提物濃度的增加而增強；不同溶劑提取吉林延齡草種子抑制物質的活性不同，以水提取液Ⅰ(C)的抑制物質活性最強，甲醇提取液Ⅰ(B)次之，乙酸乙酯提取液Ⅰ(A)無顯著抑制活性(p>0.05)，當提取液質量濃度為0.008 g/mL時，水提取液Ⅰ(C)與甲醇提取液Ⅰ(B)兩者對白菜幼苗的抑制活性無顯著性差異(p>0.05)，兩者對白菜幼根及胚軸的抑制活性分別達87.36%、88.04%和83.35%、83.72%；在種子浸提物質量濃度為0.001，0.002，0.004，0.006 g/mL培養(yǎng)時，水提取液Ⅰ(C)對白菜幼根及胚軸的抑制活性極顯著高于甲醇提取液Ⅰ(B)的抑制活性(p<0.01)(質量濃度為0.001 g/mL時對白菜胚軸抑制活性除外)；經(jīng)乙酸乙酯浸提后，甲醇提取液Ⅱ(D)與甲醇提取液Ⅰ(B)兩者抑制作用差異不顯著(p>0.05)，但其抑制作用極顯著高于對照(p<0.01)；經(jīng)甲醇浸提后，水提液Ⅱ(E)抑制作用極顯著低于水提液Ⅰ(C)對白菜幼苗的抑制作用(p<0.01)；吉林延齡草種子浸提物對白菜幼根抑制活性高于對胚軸的抑制活性。

2.2 吉林延齡草種子浸提物對水稻幼苗生長的影響

吉林延齡草種子浸提液對水稻胚芽鞘生長均無顯著抑制作用(p>0.05，數(shù)據(jù)未顯示)；由表2可知，吉林延齡草種子浸提液(乙酸乙酯提取液除外)對水稻幼根生長有顯著抑制作用，且抑制物質的活性隨著粗提物濃度的增加而增強；不同溶劑提取吉林延齡草種子抑制物質的活性不同，以甲醇提取液Ⅰ(B)的抑制活性最強，水提取液Ⅰ(C)次之，乙酸乙酯提取液Ⅰ(A)無顯著抑制活性(p>0.05)，當浸提液質量濃度為0.008 g/mL時，甲醇提取液Ⅰ(B)對水稻種子幼根抑制作用極顯著高于水提取液Ⅰ(C)的抑制作用(p<0.01)，對水稻種子幼根抑制活性分別達86.73%和82.74%；經(jīng)乙酸乙酯浸提后，甲醇提取液Ⅱ(D)與甲醇提取液Ⅰ(B)兩者抑制作用差異不顯著(p>0.05)；經(jīng)甲醇浸提后，水提液Ⅱ(E)抑制作用極顯著低于水提液Ⅰ(C)對水稻幼根的抑制作用(p<0.01)，當浸提液質量濃度為0.002 g/mL時，水提液Ⅱ(E)抑制作用不明顯，水提液Ⅰ(C)對水稻種子幼根抑制作用達極顯著性水平(p<0.01)，說明種子水提液Ⅱ(E)中可能含有甲醇提取液Ⅰ(B)中的抑制物質；當浸提液質量濃度為0.001 g/mL時，所有種子浸提液對水稻種子幼根均無顯著性抑制作用(p>0.05)，可見，吉林延齡草種子浸提物對白菜幼根及胚軸的抑制活性高于對水稻幼根的抑制活性(見表1，表2)。

表2 吉林延齡草種子浸提物對水稻根長的影響

質量濃度(10-3g/mL)浸提液根長(mm)抑制活性(%)1ck19.06±1.55Aa0A19.32±1.28Aa-1.36B18.74±1.29Aa1.68C18.70±0.73Aa1.89D18.67±1.35Aa2.05E19.76±1.55Aa-3.672ck19.06±1.55Aa0A18.79±1.43Aa1.42B8.66±0.91Cc54.56C11.33±1.08Bb40.56D8.59±1.01Cc54.93E18.96±1.49Aa0.524ck19.06±1.55Aa0A19.01±1.32Aa0.26B4.90±0.58Dd74.29C8.13±0.95Cc57.35D5.02±0.63Dd73.66E15.26±1.12Bb19.946ck19.06±1.55Aa0A18.75±1.47Aa1.63B3.10±0.47Dd83.74C5.87±0.99Cc69.20D3.23±0.53Dd83.05E10.14±1.20Bb46.808ck19.06±1.55Aa0A18.82±1.19Aa1.26B2.53±0.48Dd86.73C3.29±0.50Cc82.74D2.65±0.56Dd86.10E8.00±0.87Bb58.03

2.3 溫水浸種對去除吉林延齡草種子內源抑制物質的影響

由圖 1，圖 2，圖3可知，用 25，35 ℃和 45 ℃水浸泡吉林延齡草種子，其內源抑制物質大部分可被浸泡出來，隨著浸種時間的增加，浸提液對白菜幼根及胚軸的抑制作用呈現(xiàn)先增加而后逐漸降低的趨勢。浸提液對白菜幼根生長的抑制活性高于對胚軸的抑制活性。25 ℃水浸泡種子第3天浸提液顯著抑制白菜幼苗根長(p<0.05)，第4天浸提液對白菜幼根的抑制作用達極顯著水平(p<0.01)，第5天浸提液抑制作用達到最大，白菜幼根平均根長6.84 mm，抑制活性達65.89%，隨后浸提液抑制作用逐漸降低，第11天浸提液對白菜幼根無顯著抑制作用(p>0.05)，11 d后浸提液對白菜幼根無顯著抑制作用(p>0.05)(數(shù)據(jù)未顯示)；25 ℃水浸泡種子第5天浸提液極顯著抑制白菜胚軸生長(p<0.01)，胚軸平均長度為6.77 mm，抑制活性達25.69%，7 d后浸提液對白菜胚軸伸長無顯著抑制作用(p>0.05)。35 ℃水浸泡種子第1天浸提液對白菜幼根抑制作用達極顯著水平(p<0.01)，第3天浸提液抑制作用達到最大，白菜幼根平均根長3.58 mm，抑制活性達82.14%，隨后浸提液抑制作用逐漸降低，第7天浸提液對白菜幼根無顯著抑制作用(p>0.05)，7 d后浸提液對白菜幼根無顯著抑制作用(p>0.05)(數(shù)據(jù)未顯示)；35 ℃水浸泡種子第3天浸提液極顯著抑制白菜胚軸生長(p<0.01)，抑制活性達到最強，為59.93%，第6天浸提液對白菜胚軸伸長無顯著抑制作用(p>0.05)。45 ℃水浸泡種子第1天浸提液對白菜幼根抑制作用達極顯著水平(p<0.01)，第2天浸提液抑制作用達到最大，白菜幼根平均根長1.88 mm，抑制活性達90.62%，隨后浸提液抑制作用逐漸降低，第5天浸提液對白菜幼根無顯著抑制作用(p>0.05)，5 d后浸提液對白菜幼根無顯著抑制作用(p>0.05)(數(shù)據(jù)未顯示)；45 ℃水浸泡種子第1天浸提液極顯著抑制白菜胚軸生長(p<0.01)，第2天浸提液抑制活性達到最強，為83.86%，隨后浸提液對胚軸抑制作用逐漸降低，4 d后浸提液對白菜胚軸伸長無顯著抑制作用(p>0.05)。

3 討 論

前期研究表明，吉林延齡草種子存在胚后熟和上胚軸休眠特性[5]。植物種子中存在萌發(fā)抑制物質是導致種子休眠的一個主要因素[15]，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)吉林延齡草種子含有活性較高的內源抑制物質，對白菜幼根及胚軸，水稻幼根均有顯著抑制作用，抑制物質的生物活性隨質量濃度(在試驗范圍內)的逐漸增大而同步增強。吉林延齡草種子水提取液(C)對白菜和水稻幼苗生長的抑制活性高于甲醇提取物(B)的生物活性，吉林延齡草種子乙酸乙酯提取物對白菜和水稻幼苗無顯著抑制作用，吉林延齡草種子經(jīng)乙酸乙酯、甲醇溶液提取后，再經(jīng)蒸餾水提取獲得的水提液Ⅱ(E)對白菜和水稻幼苗生長的抑制活性顯著減弱，表明吉林延齡草種子抑制物質在甲醇溶液中溶解性較強，故推斷吉林延齡草種子萌發(fā)抑制物質為極性化合物。在植物種子休眠機理研究中，曾有報道推測植物種子中含有不飽和內酯、生物堿、氨、氰化物、有機酸、醛類、酚類等化合物可能是種子中存在的萌發(fā)抑制物質[16]，相關資料顯示，甲醇可提取植物體內多種有效成分，包含部分有機酸，酚類、苷類等化合物[17]，Masateru等報道吉林延齡草中有含有白花延齡草皂苷A和B等數(shù)十種皂苷類化合物[1-4]，近年來有研究結果表明皂苷類化合物對種子萌發(fā)及幼根伸長有較強的抑制化感效應[18]，由此推測,吉林延齡草種子甲醇提取液有較強抑制活性可能是皂苷化合物起著一定的作用，在此基礎上，本實驗室正在進行吉林延齡草種子內源抑制物質分離鑒定工作，以進一步明確抑制物質的種類及其作用機制。

注：“*”表示處理間在5%水平上存在顯著差異,“**”表示在5%水平上存在顯著差異。下同。圖1 吉林延齡草種子25 ℃水浸出液對白菜幼根及胚軸生長的影響

圖2 吉林延齡草種子35 ℃水浸出液對白菜幼根及胚軸生長的影響

圖3 吉林延齡草種子45 ℃水浸出液對白菜幼根及胚軸生長的影響

吉林延齡草種子抑制物質對白菜和水稻幼苗抑制活性不同，在種子抑制物質(甲醇提取液)質量濃度為1×10-3g/mL時，對白菜種子幼根及胚軸抑制活性分別為53.33%(p<0.01)和18.29%(p<0.01)，對水稻種子幼根及胚芽鞘均無顯著抑制作用(p>0.05)，表明不同植物種子對抑制物質的敏感程度有所差異，白菜種子對抑制物質表現(xiàn)極高的敏感度，同時，白菜種子具有一致發(fā)芽勢及較高發(fā)芽率并且比較容易獲得，可使抑制物質活性得到快速評價，因此，推薦采用籽粒飽滿的白菜種子測定種子抑制物質生物活性。

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上根據(jù)一部分抑制物質溶于水的特性，用水沖洗或浸洗種子來去除種子或果實中的抑制物質。如防風、桔梗、膜莢黃芪栽培生產(chǎn)一般播種前用40～45 ℃溫水浸種，間隔一段時間更換清水，可促進種子提早萌發(fā)和出苗整齊，水浸種的作用不僅是軟化種皮提高其通透性，更重要作用在于溫水浸種可浸泡出大量內源抑制物質，降低內源抑制物質對種子萌發(fā)和幼苗生長的抑制作用[19-21]。有研究表明，對于非水溶性的抑制物質，可以用有機試劑進行沖洗或浸洗，如黃花烏頭、返魂草、狹葉柴胡等種子用乙醚、乙醇等浸種，再將種子用清水洗凈，可提高種子發(fā)芽率或提前出苗[22-24]，但是，能否用有機溶劑浸種來改變種皮透性及浸淋掉部分抑制物質，并將其應用到藥用植物栽培生產(chǎn)上，以及浸種對出苗后植株長勢、入藥部位質量安全性等方面影響尚不明確，有待進一步研究。本研究表明，水溶液浸提吉林延齡草種子可除去中種子內大部分抑制物質，在水溫度45 ℃浸提效果最佳，浸提抑制物質的速率快，浸泡種子時間短，避免種子因長時間浸泡而受到毒害。另一方面，在研究中發(fā)現(xiàn)吉林延齡草種子成熟時種胚尚未發(fā)育完全，需要胚后熟階段，因此推測種子中存在的萌發(fā)抑制物質可能是種子成熟時胚發(fā)育不完全及影響胚進一步分化和發(fā)育的重要因素，但除去種子內抑制物質能否加快種胚形態(tài)后熟還有待進一步研究。一般而言，影響種子休眠的原因不單是由于抑制物質的存在，而是取決于萌發(fā)促進物質和抑制物質的相對水平。Amen[15]提出促進物和抑制物之間作用的觀點，闡明種子休眠的控制模式。它的基本觀點是認為種子休眠狀態(tài)決定于內源抑制物與促進物的平衡，當促進物和抑制物的平衡有利于抑制時種子發(fā)生休眠。一些研究表明，種子提早采收可避免硬實種皮的形成或化學抑制物質的大量產(chǎn)生，降低種子的休眠程度，提早采收也能干擾種子內部抑制物質的生化合成，降低其濃度，縮短發(fā)芽時間；但提前采收可能導致種子不發(fā)芽或發(fā)芽率偏低[25]。因此，下一步將開展吉林延齡草種子抑制物質與種子采收期相關性研究，尋求其最佳采收時間。

吉林延齡草種子綜合休眠(形態(tài)-生理休眠)嚴重制約了其種群自然更新速度，人工種植已成為彌補野生資源不足的主要途徑，而種子休眠的解除是人工種植亟待解決的關鍵問題之一。本研究證實吉林延齡草種子中存在活性較高的內源抑制物，同時，用45 ℃溫水浸泡可有效除去種子內大部分抑制物質，為深入探討中國野生瀕危植物吉林延齡草種子內源抑制物質種類及作用機制，內源抑制物質有效除去方法奠定基礎，為吉林延齡草種子休眠機制提供理論依據(jù)。

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