陳薛，師長(zhǎng)宏,2*

(1. 成都醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，成都　610500； 2. 第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，西安　710032)

前列腺癌作為男性泌尿生殖系統(tǒng)重要的惡性腫瘤，其發(fā)病率呈顯著增長(zhǎng)的趨勢(shì)。雖然近年來(lái)有關(guān)前列腺癌的研究逐步深入，但仍缺乏能夠準(zhǔn)確概括疾病發(fā)生發(fā)展并高效轉(zhuǎn)化入臨床研究的動(dòng)物模型。

目前已報(bào)道的前列腺癌動(dòng)物模型主要有基因工程小鼠模型(genetically engineered mouse，GEM)、細(xì)胞系異種移植模型(cell line derived xenograft， CDX)和人源性異種移植模型(patient-derived xenograft，PDX)，這些模型各具有各自的優(yōu)缺點(diǎn)和應(yīng)用范圍。GEM是研究前列腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中單一或多個(gè)基因作用的有效模型[1]，包括小鼠前列腺轉(zhuǎn)基因腺癌模型(transgenic adenocarcinoma of the mouse prostate，TRAMP)[2]以及pten和p53聯(lián)合缺失小鼠等[3]。此類(lèi)模型成本高，且模型所表現(xiàn)出的雄激素依賴性可能與臨床無(wú)關(guān)或小鼠自身不存在前列腺特異性抗原(prostate specific antigen，PSA)等問(wèn)題，使其在藥物開(kāi)發(fā)及評(píng)價(jià)的應(yīng)用受限[4-5]。據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，PC3、LNCaP和DU145細(xì)胞系是用于建立前列腺癌CDX模型的常用細(xì)胞系，穩(wěn)定成瘤的僅有PC3細(xì)胞系，但這種模型不能重現(xiàn)臨床前列腺癌的多種異質(zhì)性，不能代表癌細(xì)胞與其基質(zhì)成分之間的相互作用，不夠充分預(yù)測(cè)臨床藥物治療反應(yīng)及效果。在一項(xiàng)使用CDX模型檢測(cè)新型抗雄激素MDV-3100的研究中，藥物在LNCaP細(xì)胞系所建立的CDX模型中的反應(yīng)率達(dá)到92%，但在臨床上，MDV-3100的反應(yīng)率僅有不足50%[6]。近年來(lái)，人們嘗試將前列腺癌病人新鮮的瘤組織移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)建立PDX模型較好的保持了原發(fā)瘤的組織形態(tài)特征。但由于大部分前列腺癌的發(fā)生與激素密切相關(guān)，造成原發(fā)性前列腺癌移植小鼠后成功率較低，阻礙了PDX模型的應(yīng)用[7-9]。本文重點(diǎn)介紹了前列腺癌PDX模型建立方法的研究進(jìn)展及其在個(gè)體化治療研究中的應(yīng)用。

1　影響模型建立的因素

1.1　體內(nèi)雄激素水平

雄激素的刺激與前列腺組織的生長(zhǎng)密切相關(guān)，體內(nèi)雄激素的水平很大程度上決定了建模的成敗，而雄激素以睪丸分泌的睪酮為主。正常男性血清睪酮水平范圍為14～25.4 nmol/L，但正常免疫缺陷小鼠血清睪酮水平均數(shù)明顯低于此值，且波動(dòng)范圍較大，無(wú)法模擬正常男性血清睪酮水平。因此，建立前列腺癌PDX模型需要補(bǔ)充外源性雄激素[10-11]。另有研究表明，雄激素對(duì)前列腺細(xì)胞或組織的生長(zhǎng)發(fā)育具有雙向作用[12-13]。汪涌等[14]在LNCaP細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同劑量的人工合成雄激素R1881，發(fā)現(xiàn)其在10-9mol/L及以上濃度時(shí)抑制LNCaP細(xì)胞生長(zhǎng)，相反，在10-10mol/L及以下濃度刺激細(xì)胞生長(zhǎng)。程尚等[13]通過(guò)在前列腺癌荷瘤小鼠皮下包埋不同劑量睪酮，也證實(shí)了高劑量(20 mg)及低劑量(5 mg)補(bǔ)充對(duì)前列腺癌的生長(zhǎng)起不同作用。小鼠在去勢(shì)狀態(tài)下皮下包埋適當(dāng)劑量的雄激素能模擬前列腺癌患者的血清睪酮水平，且成瘤率高達(dá)90%[13,15]。越來(lái)越多的研究者在建立前列腺癌PDX模型時(shí)為小鼠補(bǔ)充一定劑量的外源性雄激素，以促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育和疾病進(jìn)程，從而提高前列腺癌PDX模型的成功率[16-17]。

1.2　原始腫瘤組織的特征

成功建立前列腺癌PDX模型需要高質(zhì)量的新鮮腫瘤組織[17]，并及時(shí)將其接種于小鼠體內(nèi)，以確保腫瘤組織存活及其活力。腫瘤組織離體后處于缺血缺氧狀態(tài)，而這種缺血性損傷會(huì)對(duì)組織細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育能力產(chǎn)生負(fù)面影響，進(jìn)而影響腫瘤組織的移植成功率。Young等[18]在一項(xiàng)胃癌PDX模型的研究中發(fā)現(xiàn)減少腫瘤組織離體時(shí)間和總移植時(shí)間與移植成功率呈正相關(guān)(P=0.003和P=0.01)。也有人使用切片機(jī)將瘤組織切割成約300 μm厚度，以便氧氣及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)最大限度地?cái)U(kuò)散到PDX中[19]。精確修剪用于移植的前列腺癌組織，去除電刀灼傷等機(jī)械損傷部位的同時(shí)，應(yīng)注意保留移植組織中惡性病灶[20-21]，腫瘤癌細(xì)胞數(shù)量大于50%且細(xì)胞Ki67表達(dá)陽(yáng)性也可以提高前列腺癌PDX模型的成功率[17]。另外瘤組織中TMPRSS2-ERG融合基因、腫瘤分期以及前列腺特異性抗原(PSA)、雄激素受體(androgen receptor，AR)水平等均是影響PDX模型成功的因素。TMPRSS2-ERG融合基因在前列腺癌中發(fā)生率很高，幾乎一半的患者中都存在這種基因融合，是發(fā)生最為頻繁的基因變異，TMPRSS2-ERG融合基因的發(fā)生與ERG蛋白的表達(dá)有關(guān)[22-25]， ERG蛋白表達(dá)率高則前列腺癌多為低分化期，其惡性程度高[26-28]，移植裸鼠PDX模型成功率較高。也有研究認(rèn)為，血清PSA水平短期內(nèi)快速上升，提示疾病處于進(jìn)展期，腫瘤組織惡性程度較高[17]；而AR表達(dá)與前列腺癌病理分期呈負(fù)相關(guān)[29-30]，其在雄激素依賴型前列腺癌向去勢(shì)抵抗性發(fā)展的過(guò)程中起關(guān)鍵作用，特別是AR剪接變體—AR-V7可以作為晚期前列腺癌潛在的預(yù)測(cè)性腫瘤標(biāo)志物[31]，因此，腫瘤組織中PSA、AR陽(yáng)性率對(duì)移植成功率有一定的影響。綜上所述，使用晚期或進(jìn)展期前列腺癌患者的標(biāo)本，去除物理?yè)p傷，選用高質(zhì)量的腫瘤組織及時(shí)接種至免疫缺陷小鼠可以提高PDX模型的成功率。

1.3　腫瘤基質(zhì)環(huán)境和間質(zhì)重組

人前列腺腫瘤組織移植到在小鼠體內(nèi)生長(zhǎng)需要數(shù)月不等，生長(zhǎng)緩慢且通常成活率極低。這是多因素相互作用的結(jié)果，特別是基質(zhì)微環(huán)境，包括免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和脈管系統(tǒng)等在前列腺腫瘤發(fā)生中的缺失。因此，為了重現(xiàn)基質(zhì)微環(huán)境的作用，許多實(shí)驗(yàn)室將人前列腺癌組織與新生鼠精囊間質(zhì)混合，然后共移植入小鼠體內(nèi)。結(jié)果顯示，采用這種方法為移植物提供了一個(gè)較為理想的微環(huán)境生態(tài)位，前列腺癌組織生長(zhǎng)活躍，獲得了良好的成瘤效果，且維持了人類(lèi)腫瘤組織的重要特性[32-35]。另外，也有人將瘤組織中混入基質(zhì)膠(Matrigel)或?qū)诱尺B蛋白，也獲得了較高的成功率[36]，相似的結(jié)果在其他類(lèi)型腫瘤PDX模型中也有報(bào)道[37-38]。

1.4　其他因素

已證實(shí)移植所用小鼠的免疫缺陷越高，則移植成功率會(huì)有相應(yīng)提升[39-42]。早期前列腺癌PDX研究常使用雄性裸鼠，其成瘤率較低；隨后，人們使用免疫缺陷程度更高的SCID小鼠，或者是NOG小鼠和B-NDG小鼠[42-43]。此外，關(guān)于前列腺癌組織移植位點(diǎn)，皮下移植成功率較低，通常不足10%[15, 44]；腎包膜下血管化豐富，具有良好的組織液壓力和淋巴流量，利于前列腺癌組織的生長(zhǎng)，建模成功率最高可達(dá)93.4%[19,45-47]。影響前列腺癌PDX模型成功率的許多因素尚未明確，如何提高成瘤率亟待解決。因此，進(jìn)一步驗(yàn)證并深入了解這些影響因素將有利于我們探索前列腺癌的發(fā)生發(fā)展，從而改善臨床患者的治療效果。

2　PDX模型的評(píng)估和應(yīng)用

PDX模型是否成功建立，首先是保證移植瘤組織存活，且凍存之后能夠再次在小鼠體內(nèi)復(fù)蘇并穩(wěn)定傳代。必須對(duì)傳代的移植瘤進(jìn)行多項(xiàng)檢測(cè)，確認(rèn)是否能夠重現(xiàn)前列腺癌疾病的多樣性，從而確認(rèn)與人類(lèi)原發(fā)腫瘤的一致性。

2.1　一致性分析

通過(guò)H&E染色比較原發(fā)瘤與移植瘤之間組織形態(tài)學(xué)差異是檢測(cè)前列腺癌PDX模型溯源性的重要方法。前列腺癌病理類(lèi)型中腺癌最為常見(jiàn)(>95%)，其組織結(jié)構(gòu)通常表現(xiàn)為異形核、結(jié)構(gòu)異常以及局部浸潤(rùn)，例如正常腺泡結(jié)構(gòu)變形或消失，出現(xiàn)單層上皮細(xì)胞、藍(lán)色粘蛋白、篩狀結(jié)構(gòu)或?qū)嵭猿矤?條索狀結(jié)構(gòu)等[48]。同時(shí)需對(duì)原發(fā)瘤和移植瘤進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，利用抗原抗體反應(yīng)，檢測(cè)相關(guān)抗原的分布和表達(dá)情況，確保其一致性。前列腺癌組織中最常檢測(cè)的抗原有PSA、p63、34βE12、CK5/14/18、AMACR、P504S等。PSA在大多數(shù)前列腺癌中都會(huì)有所升高，它常作為衡量患者病情進(jìn)展與患者生存期的預(yù)測(cè)因子，與Gleason分級(jí)、腫瘤分期一起決定患者的臨床治療方案[49-51]。因此，PSA常作為評(píng)價(jià)前列腺癌PDX模型保真度的檢驗(yàn)指標(biāo)之一。最近，研究人員對(duì)其所建立的異種移植物進(jìn)行分析，結(jié)果表明這些模型重現(xiàn)了臨床前列腺癌患者中常見(jiàn)的疾病變異性和異質(zhì)性，包括前列腺癌激素依賴型向非依賴型的轉(zhuǎn)分化以及人類(lèi)疾病表型中最常見(jiàn)的基因組改變：TMPRSS2-ERG重排和AR擴(kuò)增等；也有一些異種移植物在AR配體結(jié)構(gòu)域中表現(xiàn)出了mCRPC中常見(jiàn)的AR突變[52-53]。大量的分析結(jié)果顯示PDX模型可以保留原發(fā)瘤的主要特征，特別是有一部分PDX模型能夠基本模擬人類(lèi)前列腺癌進(jìn)程。此外，研究發(fā)現(xiàn)p63、AMACR、P504S等一系列前列腺癌標(biāo)記物，都能夠與PSA檢驗(yàn)相結(jié)合，將良惡性前列腺組織區(qū)分開(kāi)來(lái)，成為驗(yàn)證PDX模型與相應(yīng)患者腫瘤組織一致性的標(biāo)準(zhǔn)[54]。另外，檢測(cè)血清游離PSA和總PSA并計(jì)算二者比值，能夠提高前列腺腫瘤篩查和診斷的特異性。

工信部原材料司處長(zhǎng)張文明表示：“我們國(guó)家在繼續(xù)實(shí)施扶持國(guó)產(chǎn)鉀肥發(fā)展的優(yōu)惠政策，保障國(guó)產(chǎn)鉀肥競(jìng)爭(zhēng)力和提升自給率的同時(shí)也要加快境外鉀肥基地建設(shè)，實(shí)現(xiàn)雙輪驅(qū)動(dòng)，鞏固國(guó)內(nèi)價(jià)格洼地，從國(guó)家層面頂層設(shè)計(jì)，引導(dǎo)企業(yè)有序推進(jìn)‘走出去’步伐。對(duì)境外鉀肥基地加大支持力度，形成雙翼協(xié)同保障我國(guó)鉀肥的穩(wěn)定供應(yīng)，提升我國(guó)在國(guó)際鉀肥市場(chǎng)的話語(yǔ)權(quán)?！庇捎诟鞣矫鏃l件限制，建設(shè)一個(gè)大型鉀鹽生產(chǎn)企業(yè)從勘探、設(shè)計(jì)、建設(shè)到出成品至少需要5-7年的時(shí)間，建設(shè)周期漫長(zhǎng)且投資巨大。據(jù)了解，目前我國(guó)在境外已進(jìn)入生產(chǎn)運(yùn)營(yíng)階段的企業(yè)只有在老撾的中農(nóng)集團(tuán)和開(kāi)元集團(tuán)，它們是我國(guó)“走出去”找鉀和采鉀的企業(yè)佼佼者。

2.2　治療藥物的篩選

治療前列腺癌的藥物主要分為激素類(lèi)藥物和化學(xué)藥物。在PDX模型上進(jìn)行療效觀察，能夠?yàn)閭€(gè)體臨床患者治療提供重要參考。

2.2.1激素類(lèi)藥物

前列腺癌的發(fā)病與雄激素有關(guān)，激素類(lèi)藥物治療是晚期雄激素依賴型前列腺癌最重要的治療手段。其中，比卡魯胺具有較好的臨床效益，是臨床治療前列腺腫瘤最常用的激素類(lèi)藥物之一[55-57]。且在前列腺癌PDX模型的藥物研究中，比卡魯胺同樣顯示了延緩體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)荷瘤小鼠存活期的效果，并可以有效降低血清PSA水平[58-59]。另外一種較為常用的藥物——地蓋瑞利，可在用藥后快速降低雄激素水平，無(wú)睪酮一過(guò)性升高現(xiàn)象，且可降低PSA進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)。Charlotte等[59]建立了激素依賴性的前列腺癌PDX模型PAC120，使用地蓋瑞利和其他三種藥物單獨(dú)或聯(lián)合處理，結(jié)果顯示，地蓋瑞利與曲妥珠單抗聯(lián)合治療能夠有效抑制腫瘤生長(zhǎng)，并且?guī)缀跬耆苊饬思に靥右莠F(xiàn)象的發(fā)生，而單獨(dú)的曲妥珠單抗治療并沒(méi)有效果。

2.2.2常規(guī)化療藥物

這些校企合作的實(shí)驗(yàn)室和實(shí)習(xí)基地的建立，為學(xué)生營(yíng)造了科學(xué)實(shí)踐的環(huán)境，擴(kuò)大了實(shí)踐的機(jī)會(huì)，拓展了計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)實(shí)踐的技術(shù)領(lǐng)域，推動(dòng)了產(chǎn)學(xué)合作教育向縱深方向的發(fā)展。

21世紀(jì)以前，尚無(wú)研究證實(shí)化學(xué)療法能改善前列腺癌患者的生存，其在前列腺癌治療中主要以改善癥狀為主。直到2004年Tannock 等[60]使用多西他賽聯(lián)合潑尼松治療晚期前列腺癌，結(jié)果顯示多西他賽能有效延長(zhǎng)進(jìn)展期去勢(shì)抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer，CRPC)患者生存期，緩解癥狀。這重新燃起了化學(xué)藥物治療前列腺癌的希望，研究者們陸續(xù)發(fā)起了多個(gè)多西他賽治療前列腺癌的研究。2006年，Yao等[61]研究發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)多西他賽或去勢(shì)治療組的荷瘤小鼠相比，多西他賽治療后去勢(shì)組，表現(xiàn)出最有效的抗腫瘤作用。且經(jīng)TUNEL測(cè)定證實(shí)，該組凋亡腫瘤細(xì)胞密度明顯高于其他治療組。2008年，Yin 等[62]聯(lián)合多西他賽與單克隆抗磷脂酰絲氨酸(PS)抗體2aG4(一種血管靶向單克隆抗體)治療小鼠激素難治性前列腺癌起到了明顯的腫瘤抑制作用。其后續(xù)實(shí)驗(yàn)表明，2aG4增強(qiáng)了多西他賽抗腫瘤生長(zhǎng)和抗轉(zhuǎn)移活性的作用，且二者聯(lián)合治療的毒副作用較小。2014年，Qu等[63]將多西他賽與具有體外抗前列腺癌活性的多價(jià)植物藥物Aneustat(OMN54)結(jié)合來(lái)改善晚期前列腺癌的療效，數(shù)據(jù)顯示二者之間有顯著的協(xié)同作用，該組合增強(qiáng)了抗腫瘤活性，且未引起明顯的毒性反應(yīng)。

3　展望

建立高保真的前列腺癌PDX模型是前列腺癌生物學(xué)研究和藥物治療的基礎(chǔ)。理想的前列腺癌PDX模型不僅應(yīng)能夠維持原發(fā)腫瘤中的組織結(jié)構(gòu)、異質(zhì)性和基質(zhì)組分，其疾病的進(jìn)展過(guò)程及對(duì)藥物的反應(yīng)性也應(yīng)與臨床結(jié)果高度相似。但前列腺癌PDX模型的成功率極低，限制了其發(fā)展及應(yīng)用，如何提高成模率成為建立這種模型的關(guān)鍵。為此，科學(xué)家們進(jìn)行了多種嘗試，包括補(bǔ)充外源性雄激素、新鮮腫瘤組織與新生鼠精囊間質(zhì)重組以及“human-in-mouse”模型等[7, 64-65]；為了更精準(zhǔn)地模擬人類(lèi)前列腺癌特性，也有人將人造血干細(xì)胞或外周血單核細(xì)胞注射于小鼠開(kāi)發(fā)了“human-in-mouse”模型，以在小鼠體內(nèi)重現(xiàn)人類(lèi)部分免疫成分，提供前列腺癌生長(zhǎng)所需的免疫微環(huán)境[66-67]。這在一定程度上解決了小鼠免疫缺陷而無(wú)法用于評(píng)估抗腫瘤免疫治療的問(wèn)題。上述嘗試對(duì)前列腺癌新藥研發(fā)和作用機(jī)制研究具有重要意義，進(jìn)一步推進(jìn)了前列腺癌個(gè)體化腫瘤治療的進(jìn)程，并促進(jìn)其研究結(jié)果向臨床轉(zhuǎn)化。