邱秀文，何龍喜

(1.九江學(xué)院鄱陽湖生態(tài)經(jīng)濟(jì)研究中心，江西 九江 332005； 2.江西省林業(yè)有害生物防治檢疫局，江西 南昌 330038)

松材線蟲病(Pine wilt disease)是由松材線蟲Bursaphelenchusxylophilus引起松屬Pinus樹種毀滅性死亡的一種世界性森林病害。由于該病害具有傳播速度快，致死率高，防治難度大，生態(tài)損失重等特點(diǎn)，被稱為“松樹的癌癥”。該病害在原產(chǎn)地北美洲未對(duì)松樹造成嚴(yán)重危害，而在傳入地中國、日本、韓國、葡萄牙和西班牙卻導(dǎo)致大量松樹感病死亡，給國民經(jīng)濟(jì)和生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重?fù)p失[1-3]。近年來，很多學(xué)者對(duì)松材線蟲及其相似種的形態(tài)結(jié)構(gòu)、致病力差異、繁殖力差異、基因組以及致病相關(guān)基因等進(jìn)行了大量研究，以期闡述松材線蟲病致病機(jī)理[4-9]。但目前有關(guān)松材線蟲病致病機(jī)理仍然不清楚，這給防治工作帶來了巨大困難。有學(xué)者從松樹與松材線蟲互作關(guān)系出發(fā)，對(duì)松材線蟲侵入后寄主細(xì)胞的生理生化響應(yīng)、次生代謝物質(zhì)的產(chǎn)生和組織病理學(xué)變化等進(jìn)行了研究，認(rèn)為寄主抗病反應(yīng)所產(chǎn)生的特異性次生代謝物質(zhì)可能是致病因子或促進(jìn)了松樹的死亡[10-13]。松材線蟲病是松樹與松材線蟲互作后，線蟲突破寄主的防御系統(tǒng)，最終導(dǎo)致松樹整株感病死亡[12-14]。因此，研究松樹抗松材線蟲機(jī)制，對(duì)闡述松材線蟲病的致病機(jī)理和開展松材線蟲病可持續(xù)性防控具有重要的意義。

1 松樹與松材線蟲互作中的組織病理學(xué)研究

松樹感染松材線蟲后的癥狀發(fā)展被劃分為早期和后期兩個(gè)階段[14-15]。在感染松材線蟲早期，松樹接種點(diǎn)附近的皮層細(xì)胞和部分木質(zhì)部射線細(xì)胞被破壞，松樹樹脂減少或停止分泌，樹脂道周圍的薄壁細(xì)胞開始降解，這種生理和組織病變隨著線蟲在寄主體內(nèi)迅速擴(kuò)散而擴(kuò)展到整個(gè)植株[15-16]。有研究發(fā)現(xiàn)感染松材線蟲的黑松Pinusthunbergii薄壁細(xì)胞中的液泡變大[17]。但是，用無毒的擬松材線蟲Bursaphelenchusmucronatus接種黑松后，薄壁細(xì)胞液泡脹大的現(xiàn)象僅出現(xiàn)在接種點(diǎn)周圍的有限區(qū)域內(nèi)[17]。在病害發(fā)展的后期，松樹薄壁細(xì)胞的死亡和表皮、韌皮部、形成層的降解擴(kuò)展到整個(gè)植株，同時(shí)伴隨著蒸騰作用的減弱和水分疏導(dǎo)受阻，最終導(dǎo)致松樹死亡[6]。松樹細(xì)胞膜脂的過氧化水平能表征細(xì)胞膜的傷害程度，其經(jīng)常在抗、感病反應(yīng)中增加。通過組織病理學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)寄主的部分薄壁細(xì)胞壞死時(shí)，膜脂過氧化反應(yīng)逐漸發(fā)生，且氧化水平的增加與細(xì)胞的降解、壞死及線蟲的繁殖同時(shí)進(jìn)行?？梢姡蓸湓诟腥舅刹木€蟲病后，薄壁細(xì)胞隨著線蟲在寄主體內(nèi)遷移而不斷死亡，樹脂道遭到破壞，樹脂分泌停止，蒸騰作用減少等是松樹感染松材線蟲病的重要病理學(xué)特征。

2 松樹抗松材線蟲入侵的生理生化響應(yīng)研究

2.1 松樹抗病反應(yīng)中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究 有研究表明松樹組織的壞死或過敏性死亡(HR)是寄主與松材線蟲互作過程中的一些信號(hào)分子誘導(dǎo)產(chǎn)生的[11-13]。在松樹感病早期，其體內(nèi)乙烯含量的增加被認(rèn)為是松樹抗病反應(yīng)中的重要信號(hào)[17]。在不同抗性的松樹中，乙烯的產(chǎn)生與松樹抗病機(jī)制之間的關(guān)系存在差異。乙烯在高抗的火炬松P.taeda及抗性選育存活的黑松和赤松P.densiflora中，產(chǎn)生時(shí)間較易感病的松樹早，且易感病松樹感染松材線蟲后，乙烯的產(chǎn)生先是立即減少，隨著線蟲的增殖而大量產(chǎn)生，最后導(dǎo)致植株死亡[18-21]?；鹁嫠山臃N松材線蟲后，其體內(nèi)乙烯出現(xiàn)暫時(shí)積累和部分管胞空穴化；而喬松P.griffithii感病后盡管出現(xiàn)了乙烯積累，但幾乎找不到管胞空穴化的出現(xiàn)[17,19]。這表明乙烯在火炬松和喬松抗病反應(yīng)中的作用機(jī)制存在差異。有研究發(fā)現(xiàn)用弱毒的松材線蟲接種松樹后，并未導(dǎo)致乙烯的產(chǎn)生；而在接種弱毒松材線蟲又受水分脅迫的松樹中，乙烯的釋放更快速，且產(chǎn)生量更多[6]。有研究發(fā)現(xiàn)松材線蟲分泌的纖維素酶、果膠酶等誘導(dǎo)了松樹中乙烯的釋放[6，17]，這表明松樹體內(nèi)乙烯產(chǎn)生的強(qiáng)度高低與松材線蟲的致病力和環(huán)境脅迫關(guān)系密切。松樹在感染松材線蟲早期，隨著細(xì)胞膜脂過氧化反應(yīng)增加，薄壁細(xì)胞壞死數(shù)量增多[19]?；钚匝?ROS)、一氧化氮(NO)等在松樹感病早期細(xì)胞膜脂出現(xiàn)過氧化反應(yīng)和細(xì)胞內(nèi)含物泄漏之前大量產(chǎn)生，而這些化學(xué)分子是誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的重要信號(hào)物質(zhì)[11-13]。有研究表明火炬松、馬尾松P.massoniana和黑松感染松材線蟲后，活性氧和NO變化存在差異，與松樹的抗性和病程的發(fā)展密切相關(guān)[11-13]。由上可知，乙烯、活性氧、NO等是松樹抵御松材線蟲入侵的重要信號(hào)分子，轉(zhuǎn)導(dǎo)了寄主的抗病反應(yīng)。但是，有關(guān)松樹與松材線蟲互作中信號(hào)分子關(guān)聯(lián)性研究，以及其轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究報(bào)導(dǎo)較少，還不能全面揭示松樹抗松材線蟲機(jī)理。

2.2 松樹抗病反應(yīng)中的大分子化合物研究 松樹感染松材線蟲后，其體內(nèi)蛋白質(zhì)含量和酶活性的變化也是松材線蟲病的重要生理生化特征[22-23]。在感病早期，松樹體內(nèi)蛋白質(zhì)含量、過氧化物酶活性、酚類氧化酶活性等明顯增加，膜脂也開始氧化[23]。同時(shí)，松樹體內(nèi)的糖類物質(zhì)濃度顯著下降，其有關(guān)次生代謝物質(zhì)的產(chǎn)生和酶活性增加的反應(yīng)開始出現(xiàn)[22]。因此，松樹體內(nèi)糖類物質(zhì)含量的降低可能是由其感染松材線蟲后呼吸作用的加強(qiáng)所導(dǎo)致的，但是這種呼吸作用的加強(qiáng)和能量產(chǎn)生的增加是脫離的，從而導(dǎo)致形成層細(xì)胞分裂明顯減少，松樹生長(zhǎng)量減少。有研究發(fā)現(xiàn)健康的火炬松、硬葉松P.rigida體內(nèi)含有一種可溶解于水的化合物，其活性可抑制松材線蟲的擴(kuò)展，且這種物質(zhì)的活性會(huì)因松材線蟲或無毒的擬松材線蟲誘導(dǎo)而增強(qiáng)[14,23]。有研究表明馬尾松種源體內(nèi)的游離氨基酸含量高低與抗松材線蟲能力呈負(fù)相關(guān)[20]?？梢姡煌乃煞N其抗病機(jī)制存在差異，有的松樹可能存在固有的抗病物質(zhì)或結(jié)構(gòu)，有的可能需要病原誘導(dǎo)產(chǎn)生抗性。有研究表明在松材線蟲大量繁殖之前，隨著感病松樹體內(nèi)薄壁細(xì)胞中液泡的擴(kuò)展，丹寧酸的含量也不斷增加。但是在線蟲繁殖盛期及松樹萎蔫癥狀出現(xiàn)時(shí)，卻未發(fā)現(xiàn)大量的丹寧酸[19,21]。而用無毒的擬松材線蟲接種黑松，卻沒有發(fā)現(xiàn)丹寧酸的含量發(fā)生顯著變化[20]。由此可見，丹寧酸的產(chǎn)生是松樹感染松材線蟲病程度高低的重要生理生化指標(biāo)。現(xiàn)已證實(shí)松材線蟲能分泌許多大分子化合物，如纖維素酶、果膠酶、過氧化氫酶、蛋白酶和淀粉酶等。松材線蟲病的病理反應(yīng)可能是由一種或幾種大分子化合物主導(dǎo),也有可能是由多種大分子化合物共同參與作用的結(jié)果。

2.3 松樹抗病反應(yīng)中產(chǎn)生的植物毒素研究 許多研究表明，受害松樹木質(zhì)部薄壁細(xì)胞和樹脂道薄壁細(xì)胞在松材線蟲到達(dá)之前就發(fā)生了病變和死亡，并認(rèn)為這種現(xiàn)象可能與松樹感病后產(chǎn)生的異常代謝物質(zhì)有關(guān)[27-28]。Oku首先提出松材線蟲發(fā)病可能涉及植物保衛(wèi)毒素[22]。自20世紀(jì)80年代以來，研究者先后從感染松材線蟲的松樹體內(nèi)分離到苯甲酸(BA)、兒茶酚(CA)、8-羥基香芹軟酮(8-HCA)、二氫松柏醇(DCA)和10-羥基馬鞭烯酮(10-HV)、苯乙酸(PA)和2-甲氧基肉桂酸等植物毒素，并證明這些毒素與松樹萎蔫有直接關(guān)系[8]。BA、CA對(duì)松樹的毒性比DCA、PA和8-HCA強(qiáng)[8]。這些有毒物質(zhì)主要是在松樹抵抗松材線蟲入侵過程中產(chǎn)生的一些次生代謝物質(zhì)。Zhang等對(duì)抗性和易感病黑松分別接種松材線蟲后的代謝物進(jìn)行了分析比較，發(fā)現(xiàn)在線蟲增殖階段，亞油酸(LA)在抗性黑松中的含量是易感病黑松品種的2倍；苯甲酸在抗性黑松中含量很低，但在易感病的品種中則隨著線蟲數(shù)量的快速增加而迅速積累[26]。同時(shí)，研究還發(fā)現(xiàn)在感病黑松中內(nèi)源殺線蟲物質(zhì)銀松素和銀松素甲基謎顯著高于抗性品種[26]。有研究表明在樟子松P.sylvestnis接種松材線蟲后，其體內(nèi)具有殺線蟲作用的脫氫松香含量增加，而在健康的樟子松中含量豐富的松香酸卻沒有殺線蟲活性[27]。這暗示松材線蟲可誘導(dǎo)松樹產(chǎn)生一些植物毒素，抵御線蟲入侵，但是過多的植物毒素積累會(huì)對(duì)自身細(xì)胞組織造成傷害。因此，松樹產(chǎn)生植物毒素的代謝途徑可能是松樹抗病的重要機(jī)制。隨著研究的不斷深入，更多的毒素將會(huì)被分離和鑒定，究竟是哪一種毒素在松樹萎蔫過程中起主導(dǎo)作用及相關(guān)作用機(jī)制仍然不清楚。

3 松樹抗松材線蟲病分子生物學(xué)研究

近年來，有關(guān)松樹抗松材線蟲病的分子生物學(xué)機(jī)理研究成為熱點(diǎn)，并通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)和基因組學(xué)發(fā)現(xiàn)了一些與松樹抗病相關(guān)的基因。Kuroda等對(duì)不同抗性赤松接種松材線蟲后的轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)ESTs基因序列在抗性赤松中較感病的更豐富，認(rèn)為這種現(xiàn)象是由于松材線蟲誘導(dǎo)了抗性赤松的相關(guān)抗性基因的表達(dá)，而在易感病的品種中抗性基因表達(dá)受到了一定的抑制，或者是抗性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受到了阻礙，導(dǎo)致ESTs基因序列較少[29]。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)黃酮類、酚類化合物合成相關(guān)基因在抗性松樹中表達(dá)明顯高于感病松樹；一些病程相關(guān)蛋白(PR蛋白)在感病赤松上出現(xiàn)了上調(diào)表達(dá)，而在抗性品種中未被發(fā)現(xiàn)[29]。Nose等對(duì)抗、感病的黑松接種松材線蟲后的基因表達(dá)進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)抗性黑松品種在接種線蟲后，PR-2、PR-4、滲調(diào)蛋白、脂肪氧合酶、查爾酮合酶等蛋白基因表達(dá)出現(xiàn)了明顯上調(diào)；過氧化物酶、水解酶相關(guān)基因在抗性品種中較易感病的上調(diào)表達(dá)更顯著[30]。這些差異表達(dá)的基因可能反映了抗性和易感病黑松對(duì)松材線蟲的抗性差異[30]。Xu等對(duì)馬尾松感染松材線蟲早期的基因表達(dá)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)接種72 h后，應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因開始出現(xiàn)高表達(dá)，馬尾松樹體內(nèi)的水解酶基因表達(dá)較豐富，而解毒相關(guān)基因和氧化還原酶基因表達(dá)較少[31]。這些與松樹抗松材線蟲相關(guān)的分子生物學(xué)研究為尋找抗性基因，并通過基因克隆和基因融合技術(shù)應(yīng)用于抗性育種，奠定了理論基礎(chǔ)，也為闡明松材線蟲分子致病機(jī)理提供了參考。

4 松樹抗病反應(yīng)對(duì)松材線蟲擴(kuò)展和繁殖的影響

研究松樹對(duì)松材線蟲的抗病反應(yīng)是闡釋松樹抗病機(jī)制的重要途徑。松樹的抗病反應(yīng)不僅可以阻礙松材線蟲在松樹體內(nèi)迅速擴(kuò)展，而且能抑制線蟲在寄主體內(nèi)迅速繁殖，從而延緩松材線蟲病的發(fā)展。有研究表明松材線蟲在火炬松體內(nèi)的移動(dòng)速度較感病的黑松慢。但是不管在抗性松樹還是易感松樹中，線蟲仍能分布到整個(gè)松樹體內(nèi)[3]。有研究表明松材線蟲很難侵入火炬松的組織，即使侵入也不能馬上增殖；但能侵入抗病的喬松、感病的黑松和赤松組織[3,19]。并且研究發(fā)現(xiàn)在喬松感染松材線蟲的早期和擴(kuò)展期的組織形態(tài)學(xué)存在著明顯的不同[3,19]，這種差異與喬松接種松材線蟲后的動(dòng)態(tài)防衛(wèi)反應(yīng)較一致。Zhang 等比較分析了接種2周至1個(gè)月后的抗性黑松和感病黑松體內(nèi)的松材線蟲數(shù)量，發(fā)現(xiàn)線蟲在感病黑松體內(nèi)迅速增殖，而在抗性黑松中增殖較慢[26]。有研究發(fā)現(xiàn)松材線蟲剛侵入喬松時(shí)遷移速度較在火炬松中快，這可能是因?yàn)樵诨鹁嫠芍斜緛砭痛嬖谥承┑挚顾刹木€蟲入侵的物質(zhì)；而喬松在松材線蟲誘導(dǎo)下才產(chǎn)生大量的植保素，以致線蟲數(shù)量下降，甚至被消滅[3]。結(jié)構(gòu)性抗病方面，在健康的火炬松中觀察到，其能阻礙線蟲的移動(dòng)并抑制線蟲的繁殖。有研究發(fā)現(xiàn)松材線蟲能在死亡的火炬松中繁殖，這表明抗性松樹的抗病性只有在其健康狀態(tài)下才表現(xiàn)明顯。另外，通過離體的松樹枝條試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在沒有提供足夠營(yíng)養(yǎng)和能量的條件下，松樹對(duì)松材線蟲的防御反應(yīng)會(huì)長(zhǎng)時(shí)間癱瘓。黑松針葉的去除和對(duì)其進(jìn)行光反應(yīng)的抑制處理能夠使弱毒松材線蟲和擬松材線蟲在黑松體內(nèi)繁殖，并最終導(dǎo)致黑松死亡[21-22]。同時(shí)，也有研究表明水分脅迫也能加速松材線蟲病的發(fā)展[17]。因此，松材線蟲入侵松樹后遷移和繁殖與松樹的結(jié)構(gòu)性抗病和誘導(dǎo)性抗病密切相關(guān)，同時(shí)也受環(huán)境因素的影響。篩選結(jié)構(gòu)性抗性基因?qū)剐杂N具有重要的意義。

5 總結(jié)

松樹體內(nèi)存在許多抵御松材線蟲入侵的相關(guān)因子，并且不同松種的抗病機(jī)制可能存在差異。松樹在感染松材線蟲后，其體內(nèi)的生理生化反應(yīng)如乙烯的產(chǎn)生、丹寧酸的積累、膜脂過氧化反應(yīng)、過氧化物酶活性增加和呼吸作用增強(qiáng)等不是同時(shí)產(chǎn)生的，而是在一系列的反應(yīng)中相互替代而相互聯(lián)系的。這些反應(yīng)都是松樹抵御松材線蟲入侵的生理生化響應(yīng)，且相互替代導(dǎo)致了松材線蟲病的不斷擴(kuò)展，加速了松樹感病死亡。因此，上述相關(guān)松材線蟲病中的生化反應(yīng)可能是松材線蟲病致病機(jī)理的重要組成部分。但是，目前的研究往往只關(guān)注于松樹抗病反應(yīng)中某一方面的因子，對(duì)各因子之間的聯(lián)系研究較少。另外，松材線蟲入侵松樹后，對(duì)寄主與線蟲互作方面的研究也不夠深入，有些抗病反應(yīng)遠(yuǎn)比現(xiàn)在已認(rèn)識(shí)到的復(fù)雜。同時(shí)，闡釋寄主抗病反應(yīng)的機(jī)理在選育抗性的松樹品種和家系中具有重要的指導(dǎo)作用。因此，要加強(qiáng)有關(guān)松樹與松材線蟲互作后的反應(yīng)及其分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究，并把不同的生理生化反應(yīng)和代謝途徑聯(lián)系起來，闡明松樹抗病反應(yīng)中的信號(hào)分子及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。這些研究對(duì)闡述松材線蟲病的致病機(jī)制和松樹的抗病機(jī)制以及指導(dǎo)抗性育種工程的實(shí)施都具有重要的意義。