劉天驕，代翠紅，程大友，崔 杰，羅成飛

(哈爾濱工業(yè)大學(xué) 化工與化學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150090)

0 引言

甜菜(Beta vulgaris ssp. vulgaris)是溫帶地區(qū)重要的產(chǎn)糖作物。據(jù)聯(lián)合國糧食農(nóng)業(yè)組織(FAO)統(tǒng)計(jì)，世界每年30%的植物糖產(chǎn)量均出自于甜菜。我國目前甜菜的種植面積每年維持在22.4萬公頃左右，主要種植地區(qū)在黑龍江內(nèi)蒙新疆等中國北方地區(qū)。糖是甜菜的主要產(chǎn)品，是人民生活不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)，也是食品工業(yè)，飲料工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)的重要原料[1]。除生產(chǎn)蔗糖外，甜菜及其副產(chǎn)品還有廣泛開發(fā)利用前景。鑒于甜菜廣泛的應(yīng)用性，培育高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)品種成為甜菜育種工作中的主要目標(biāo)。

甜菜屬于典型的利用雜種優(yōu)勢現(xiàn)象進(jìn)行繁育的異花授粉作物，要獲得更高的產(chǎn)量，必須利用雜種優(yōu)勢特性。提高雜交效率有三個途徑：人工去雄、化學(xué)去雄以及細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的利用。但甜菜為雌雄同花且花器較小、無限花序的二年生作物[2]。人工去雄生產(chǎn)雜交種幾乎不可能，因此要充分利用雜種優(yōu)勢必須選育不育系、保持系和授粉系。而三系的選育中，不育系和保持系的選育又是其工作的關(guān)鍵和核心[3]。收獲時只收取母本上的種子，這樣的種子雜交率高、純度好，在田間的表現(xiàn)也趨于一致。因此如何快速選育甜菜保持系和不育系也一直是國內(nèi)外甜菜育種科技工作者研究的重點(diǎn)[4，7]。

不育系育性分為細(xì)胞核雄性不育、細(xì)胞質(zhì)雄性不育以及質(zhì)核互作雄性不育。生產(chǎn)上使用的甜菜品種基本都是以細(xì)胞質(zhì)雄性不育系為母本，優(yōu)良授粉系作為父本雜交而成。細(xì)胞質(zhì)雄性不育是核-質(zhì)關(guān)系不協(xié)調(diào)導(dǎo)致的花粉敗育[5]。細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)是細(xì)胞賴以生存的基礎(chǔ)，失活細(xì)胞具有核遺傳系統(tǒng)與細(xì)胞質(zhì)遺傳系統(tǒng)，其中胞質(zhì)遺傳系統(tǒng)包括葉綠體、線粒體遺傳系統(tǒng)[6]。核-葉綠體-線粒體三者既相互獨(dú)立，又相互聯(lián)系、滲透、影響。在長期的系統(tǒng)進(jìn)化中，植物形成了三者協(xié)調(diào)的關(guān)系，從而保證了植物正常生長發(fā)育。然而一旦協(xié)調(diào)被打破，花粉發(fā)育過程中核質(zhì)之間正常的信息交流改變，導(dǎo)致花粉敗育[8]。

近年來，分子輔助育種技術(shù)的研究與傳統(tǒng)育種方法相結(jié)合使得作物育種工作和目標(biāo)有了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，育種家也把研究重點(diǎn)放在植物的分子水平，從基因組、轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組中探尋高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)資源[6，9，10，11，16]。因此，隨著新一代高通量測序，包括denovo從頭測序、轉(zhuǎn)錄組測序、基因組重測序等技術(shù)的推廣，RNA測序技術(shù)這一新興分子生物學(xué)與生物信息學(xué)相結(jié)合的技術(shù)憑借其信噪比高、分辨率高、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)勢，在基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中成為重要的實(shí)驗(yàn)手段，在諸多基因組學(xué)相關(guān)的研究中均被廣泛應(yīng)用并為后基因組學(xué)研究提供了大量的數(shù)據(jù)支持[13，14，15]。本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對甜菜質(zhì)核互作型雄性不育系及保持系花蕾發(fā)育的3個階段基因差異表達(dá)進(jìn)行研究，以期揭示Owen型甜菜不育系與保持系花蕾不同發(fā)育時期基因表達(dá)的差異．

1 材料方法

1.1 供試材料

所用材料來自本課題組自育的甜菜不育系DY5-CMS及其保持系DY5-O。經(jīng)過春化處理的甜菜母根，種植在甜菜育種試驗(yàn)田，6月-7期間進(jìn)行甜菜花期取樣。甜菜花蕾發(fā)育分成3個時期；雄蕊原基分化期(I期)、四分體時期(II期)及單核時期(III期)。本實(shí)驗(yàn)分別選取甜菜dy5保持系O及雄性不育系CMS的I期、II期和III期花蕾作為實(shí)驗(yàn)樣本，委托晶能生物技術(shù)(上海)有限公司，采用illumina Hiseq2000測序平臺的雙端100 bp測序模式分別對這6組樣本進(jìn)行高通量測序。原始數(shù)據(jù)經(jīng)過引物與接頭序列去除， 最終保留高測序質(zhì)量的堿基片斷。保留的測序序列(remained reads)片斷用于后續(xù)RNA-Seq項(xiàng)目分析模塊的分析。

1.2 測序分析

1.2.1 表達(dá)譜測序質(zhì)量控制分析

深度轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)提供了探索基因組功能元件的技術(shù)平臺。使用RNA-Seq 數(shù)據(jù)不僅可以獲得基因表達(dá)譜機(jī)器改變，探索可變剪切事件，識別新轉(zhuǎn)錄本及其區(qū)域，探索異常轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)(例如基因融合)或編碼區(qū)變異體。同時，RNA-Seq也可以探索低頻率表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本。RNA-Seq是一項(xiàng)復(fù)雜多步驟實(shí)驗(yàn)分析過程，其中涉及到樣本制備，擴(kuò)增，片段化，純化以及測序過程，對RNA-Seq數(shù)據(jù)的質(zhì)量的有效評估是進(jìn)一步完成測序分析的關(guān)鍵。本項(xiàng)分析將針對項(xiàng)目內(nèi)各個樣本的RNA-Seq數(shù)據(jù)依次進(jìn)行綜合的質(zhì)量評估。6個樣本的測序結(jié)果分別得到了37～42 M的總reads數(shù)目，未出現(xiàn)質(zhì)控失效和非匹配的reads，通過雙端測序獲得20 M數(shù)據(jù)深度。根據(jù)反饋的reads覆蓋度分布圖得出測序結(jié)果不存在5′/3′偏差，RNA-Seq測序?qū)嶒?yàn)質(zhì)量很好，可用于后續(xù)的進(jìn)一步數(shù)據(jù)分析。

1.2.2 測序數(shù)據(jù)分析

1.2.2.1 基因組比對

將樣本預(yù)處理后序列與參考基因組序列進(jìn)行全基因組序列比對，計(jì)算序列的全基因組覆蓋情況和計(jì)算RNA的表達(dá)量。 序列比配考慮到RNA結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，采用Tophat軟件完成基因組比對。比配參數(shù)和比配滿足以下條件：允許2錯配堿基匹配模式；允許每個read測序序列最多20個最優(yōu)比配記錄；考慮可變剪切情況，分割片段區(qū)域(segment) 的分段長度設(shè)定等于read長度的1/2；允許分段內(nèi)錯配堿基數(shù)目最多2 bp；最大插入和刪除長度設(shè)定為3 bp；可變剪接位置匹配要求0錯配，即保證完全比對；最小異構(gòu)體比例系數(shù)設(shè)定為0.15；最小內(nèi)含子長度設(shè)置為50 bp；最大內(nèi)含子長度設(shè)置為50 kbp；對junction探測的比對條件允許最多40個最優(yōu)比配記錄，允許2 bp的錯配。過濾掉較低質(zhì)量比對reads后，6個樣本分別獲得20 M以上的有效下機(jī)數(shù)據(jù)總read數(shù)。保留下20 M的測序數(shù)據(jù)read總數(shù)目用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組分析。

1.2.2.2 已知基因表達(dá)量計(jì)算分析

編碼RNA表達(dá)量計(jì)算采用將序列拼裝比對在基因組序列上，并通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法估算其表達(dá)量，并用于后續(xù)樣本差異表達(dá)量的比較分析。RNA表達(dá)量計(jì)算采用FPKM計(jì)算度量指標(biāo)。數(shù)據(jù)分析結(jié)果得到甜菜mRNA編號及名稱、基因ID、mRNA坐標(biāo)及其表達(dá)量度量結(jié)果等。

1.2.2.3 已知基因差異表達(dá)分析

差異表達(dá)分析目的是對分組之間的表達(dá)譜進(jìn)行差異分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性選擇經(jīng)過多重假設(shè)檢驗(yàn)校正后的q value<=0.05。對甜菜dy5-O和dy5-CMS兩種品系的3期花蕾進(jìn)行表達(dá)差異分析，在所得結(jié)果中列出了甜菜mRNA編號名稱及其坐標(biāo)、基因ID、樣本表達(dá)量差異、p/q值、轉(zhuǎn)錄本長度以及對象區(qū)域內(nèi)reads覆蓋度等。根據(jù)所獲得的分析結(jié)果可進(jìn)行已知基因差異表達(dá)分析及其后續(xù)研究。

1.2.2.4 差異表達(dá)基因GO功能分析

GO功能聚類常用于對目標(biāo)組基因進(jìn)行功能注釋與分類。全部或差異mRNA/基因功能聚類(富集度)分析采用GO注釋系統(tǒng)，功能注釋針對全部差異mRNA結(jié)果展開。富集度分析采用超幾何分布算法與Fisher檢驗(yàn)完成，并采用多重假設(shè)檢驗(yàn)校驗(yàn)超幾何分布統(tǒng)計(jì)量的p值， 獲得校正后的p值， 即q值。根據(jù)差異分析q value=0.05閾值篩選出差異基因，得到GO富集度分析后顯著的GO各項(xiàng)分類內(nèi)的條目優(yōu)先的前30～50位GO子分類功能柱形圖。根據(jù)所得的柱形圖及GO注釋總表可進(jìn)行相應(yīng)的差異表達(dá)基因的GO功能分析。

1.2.2.5 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證

按照說明書配制熒光定量PCR混合液。先根據(jù)所需PCR體系數(shù)，將除反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以外的所有試劑按照上表的倍數(shù)由加入量從大到小的順序加入1.5 mL離心管中，反復(fù)吹打混勻，低速、短時間離心后再分裝，加入到熒光定量PCR專用的八連管中，最后加入相應(yīng)稀釋后的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，佩戴EP手套壓蓋，充分離心混合，放入ABI7300實(shí)時定量PCR儀，運(yùn)行程序。反應(yīng)程序設(shè)定：Stage 1：預(yù)變性 95℃ 30 s；Stage 2：PCR 反應(yīng)40個循環(huán)，95℃ 5 s、60℃ 31 s；Dissociation Stage。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)分別選取甜菜dy5保持系O及雄性不育系CMS的I期、II期和III期花蕾作為實(shí)驗(yàn)樣本，根據(jù)數(shù)據(jù)分析結(jié)果進(jìn)行在線GO分析與BLAST比對分析已知，在I期花蕾中差異表達(dá)最高的是分子生物學(xué)功能中的氧化還原酶活性；在II期花蕾中差異表達(dá)最高的是細(xì)胞組件作用中的細(xì)胞外區(qū)域結(jié)構(gòu)；在III期花蕾中差異表達(dá)最高的是分子生物學(xué)功能中的催化活性。I/II/III期共同的差異表達(dá)基因GO分類中，表達(dá)差異最高的分類中出現(xiàn)頻率較多的幾種分類分別為線粒體電子傳遞、有氧電子傳遞鏈、細(xì)胞膜光捕獲復(fù)合物、亞油酸氧化物酶活性等。

2.2 育性相關(guān)差異基因篩選

轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)經(jīng)生物信息學(xué)分析獲得的不育系材料(CMS)與保持系材料(O)在不同花期(I/II/III)表達(dá)量。獲得I期差異表達(dá)基因共有3 651個；II期差異表達(dá)基因共有4 408個；III期差異表達(dá)基因共有3 643個。篩選所得不育系材料(CMS)與保持系材料(O)在不同花期(I/II/III)表達(dá)量差異在1倍以上的基因分別為327、1 446和554個。分別對這些差異基因進(jìn)行NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST比對，其基因功能涉及到轉(zhuǎn)錄因子基因、ATP合成基因、激酶合成基因、HIS組蛋白合成基因、酶及次級活性物質(zhì)合成基因、孢子體形成基因、離子結(jié)合與調(diào)控基因等。

2.3 差異表達(dá)記憶實(shí)時熒光定量PCR驗(yàn)證

篩選出部分與育性相關(guān)基因進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證基因差異表達(dá)的時空特性，表達(dá)情況與測序結(jié)果基本一致。

3 討論

在不同發(fā)育時期差異基因的上下調(diào)表達(dá)趨勢與測序結(jié)果基本一致。育性相關(guān)的差異基因在CMS材料中均出現(xiàn)不同程度表達(dá)下調(diào)的現(xiàn)象，可能與雄性不育植株的花器官敗育有一定的聯(lián)系。獲得的甜菜雄性不育性狀轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)分析完成影響育性基因表達(dá)情況的關(guān)鍵基因及其通路的研究，篩選出多個控制育性性狀的標(biāo)簽基因并定位到響應(yīng)區(qū)域并進(jìn)行后續(xù)的表觀研究。

組學(xué)數(shù)據(jù)龐大冗余，從中篩選相關(guān)的目的基因相對比較困難，與育性相關(guān)的通路繁雜，需要結(jié)合基因組注釋與比對結(jié)果進(jìn)行篩選。后期分子生物學(xué)與表觀研究需精確的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

5 結(jié)論

(1)獲得I期差異表達(dá)基因共有3 651個；II期差異表達(dá)基因共有4 408個；III期差異表達(dá)基因共有3 643個。

(2)篩選所得不育系與保持系在不同花期(I/II/III)表達(dá)量差異在1倍以上的基因分別為327、1 446和554個。經(jīng)分析，其功能涉及到轉(zhuǎn)錄因子、ATP合成、激酶合成、HIS組蛋白合成、酶及次級活性物質(zhì)合成、孢子體形成、離子結(jié)合與調(diào)控等。