王 玥，代翠紅，孟祥文，崔 杰，程大友

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 150001；2.湖北科技學(xué)院，湖北 咸寧 437100)

0 前言

低溫影響了植物的正常生長、發(fā)育、繁殖及其種植范圍，并且在一定程度上限制了農(nóng)業(yè)發(fā)展，屬于非生物脅迫。因此，對于植物抗低溫脅迫的研究也就顯得尤為重要。植物的低溫脅迫可分為冷害和凍害，前者是指在0℃以上的低溫時(shí)，植物細(xì)胞雖然沒有結(jié)冰，但會引起生理障礙，最終導(dǎo)致植物受傷或死亡。而后者則是指在0℃以下使植物組織結(jié)冰而引起的傷害。植物適應(yīng)冰點(diǎn)以上低溫稱為抗冷性，適應(yīng)冰點(diǎn)以下低溫稱為抗凍性，二者統(tǒng)稱為植物的抗寒性。植物抗寒性的研究最早開始于18世紀(jì)末，當(dāng)時(shí)研究者主要從植物受寒害后的細(xì)胞形態(tài)和理化性質(zhì)等方面進(jìn)行研究。隨著生物信息學(xué)和分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，從分子水平對植物低溫脅迫進(jìn)行研究成為了近些年來的熱點(diǎn)。同時(shí)也促進(jìn)了基因工程的發(fā)展，研究者們希望通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)來提高植物的抗寒性，進(jìn)而提高作物的產(chǎn)量，并在一定程度上減少植物的地理局限。本文將從不同方面對植物抗寒機(jī)理的研究進(jìn)行綜述，以期使植物抗寒機(jī)理的研究更為完善。

1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)與植物抗低溫脅迫的研究

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是指從細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面進(jìn)行研究，也可以看作分析細(xì)胞在不同時(shí)期或不同條件下的總RNA。在轉(zhuǎn)錄組學(xué)水平上研究植物抗寒機(jī)理，對應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高植物耐低溫性具有重要的實(shí)際意義。而轉(zhuǎn)錄因子作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控中具有重要作用的因素，已成為近些年來的研究熱點(diǎn)。目前發(fā)現(xiàn)的與植物低溫脅迫有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子主要有AP2/ERF、MYB、NAC、bZIP、和WRKY等。

1.1 AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子

AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子是植物轉(zhuǎn)錄因子中的大家族，因含有AP2/ERF結(jié)構(gòu)域而得名，由57～70個(gè)氨基酸組成，與植物抗低溫脅迫密切相關(guān)。這類轉(zhuǎn)錄因子的大量表達(dá)，可以明顯的提高植物抵御低溫的能力。從擬南芥中發(fā)現(xiàn)的DREB1/CBF已經(jīng)被證實(shí)是一種植物低溫脅迫調(diào)節(jié)因子，該轉(zhuǎn)錄因子同樣在水稻、菊花等植物中被發(fā)現(xiàn)。但其家族中各類轉(zhuǎn)錄因子的具體表達(dá)機(jī)制尚不清楚，現(xiàn)階段的研究只能證明植物抗寒基因的表達(dá)是他們共同作用的結(jié)果。

1.2 MYB類轉(zhuǎn)錄因子

MYB類轉(zhuǎn)錄因子是指家族中含有MYB結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，該結(jié)構(gòu)域一般由51～52個(gè)氨基酸組成，每隔18個(gè)左右的氨基酸就有一個(gè)色氨酸殘基。植物中主要存在的是含有2個(gè)R的R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子。水稻中發(fā)現(xiàn)的與植物抗寒相關(guān)的MYB類轉(zhuǎn)錄因子有OsMYB3R-2和OsMYB4。其中OsMYB4是通過使細(xì)胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)含量提高來增強(qiáng)植物的抗寒性。擬南芥中的轉(zhuǎn)錄因子MYB15通過抑制CBFs的表達(dá)對植物低溫脅迫進(jìn)行負(fù)調(diào)控。

1.3 NAC類轉(zhuǎn)錄因子

NAC類轉(zhuǎn)錄因子是植物所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，同時(shí)也是植物轉(zhuǎn)錄因子中的大家族之一。其N端含有約150個(gè)氨基酸組成的高度保守的NAC結(jié)構(gòu)域，C端為轉(zhuǎn)錄激活區(qū)。研究表明，NAC類轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)對非生物脅迫方面具有重要的作用。過表達(dá)水稻中的SNAC2可以提高植物的耐寒能力，而SNAC1雖然與水稻抗寒性有關(guān)，但其過表達(dá)卻不會使水稻耐寒能力提高。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小麥中的TaNAC2和TaNAC2a也能受到低溫脅迫的誘導(dǎo)，從而證明了他們與小麥抗寒機(jī)理有關(guān)。

1.4 bZIP類轉(zhuǎn)錄因子

bZIP(basic leucine zipper，亮氨酸拉鏈)轉(zhuǎn)錄因子的N末端含有酸性激活區(qū)，并以二聚體的形式與DNA結(jié)合。該類轉(zhuǎn)錄因子所能識別的順式作用元件的核心序列為ACGT，如TACGTA(A盒)、CACGTG(G盒)、GACGTC(C盒)等。bZIP類轉(zhuǎn)錄因子可以通過提高植物的光合作用進(jìn)而增強(qiáng)植物的抗寒性。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中ABF1和水稻中OsbZIP16參與低溫應(yīng)答，并且將水稻中的bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因GmbZIP44和GmbZIP46等在擬南芥中過表達(dá)，可以提高擬南芥的抗寒能力。

1.5 WRKY類轉(zhuǎn)錄因子

WRKY轉(zhuǎn)錄因子最大的特點(diǎn)就是DNA結(jié)合域都至少含有一個(gè)由60個(gè)氨基酸組成的WRKY結(jié)構(gòu)域，其N端是由WRKYGQK組成的7個(gè)高度保守的氨基酸序列。目前發(fā)現(xiàn)的與植物低溫應(yīng)答有關(guān)的WRKY類轉(zhuǎn)錄因子包括：黃瓜CsWRKY46和CsWRKY21(它們都是低溫脅迫的正調(diào)控因子)、大麥Hv-WRKY38以及水稻中發(fā)現(xiàn)的10個(gè)與低溫脅迫有關(guān)的WRKY類基因。雖然WRKY類轉(zhuǎn)錄因子在大多數(shù)的植物中都已證實(shí)與植物抗寒機(jī)理有關(guān)，但對其具體調(diào)控體制的了解卻很少，有待進(jìn)一步研究。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)與植物抗低溫脅迫的研究

蛋白質(zhì)組學(xué)就是研究一套基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中所表達(dá)的全套蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)是基因選擇性表達(dá)的結(jié)果，因此通過對蛋白質(zhì)的研究，可以使我們更深入的了解生物的生命活動。在植物應(yīng)答低溫脅迫方面，蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用有助于詳細(xì)分析植物抗寒機(jī)理和適應(yīng)機(jī)制。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究技術(shù)有很多，其中常用的有雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D-PAGE)、蛋白質(zhì)芯片(Protein chips)技術(shù)、質(zhì)譜(Mass-spectrometric)技術(shù)和酵母雙雜交系統(tǒng)(Yeast two-hybrid system)等。目前對于草本植物在低溫脅迫下的蛋白質(zhì)組學(xué)研究的較多，例如對擬南芥和水稻等模式植物的研究。關(guān)于木本植物雖然研究的較少，但也取得了不錯(cuò)的進(jìn)展。

2.1 蛋白質(zhì)組學(xué)在草本植物低溫脅迫中的研究

2.1.1 水稻抗低溫脅迫的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

水稻是我國主要糧食作物，同時(shí)也是科研中典型的模式植物。近些年來，隨著對水稻基因組的了解，加速了蛋白質(zhì)組學(xué)在探求水稻抗寒作用機(jī)理發(fā)面的發(fā)展，為研究出抗低溫水稻提供了實(shí)質(zhì)性的幫助。Lee等早在2007年就提出了一種識別應(yīng)答寒脅迫下低豐度水稻葉片蛋白質(zhì)的方法。他們將水稻置于5或10℃處理不同的時(shí)間，應(yīng)用質(zhì)譜檢測到了12個(gè)上調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，如半胱氨酸蛋白酶、鋅指蛋白及胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白等多種蛋白，這幾種蛋白是以前從未報(bào)道過的。這些蛋白可能會產(chǎn)生一種動態(tài)平衡來抵御低溫環(huán)境。也有研究者在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了一種磷酸化鈣網(wǎng)蛋白，該蛋白可以調(diào)控其他蛋白的表達(dá)。研究表明植物抗低溫脅迫與其蛋白質(zhì)的合成、折疊及細(xì)胞壁的合成都有一定關(guān)系，并且約43%與低溫脅迫相關(guān)的蛋白質(zhì)都位于葉綠體中，這說明光合作用可能也影響著植物耐低溫能力。

2.1.2 擬南芥抗低溫脅迫的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

擬南芥的結(jié)構(gòu)簡單，生長周期短，且基因組是目前已知的高等植物中第二小的因此成為了廣泛研究的模式植物，被科學(xué)家們譽(yù)為“植物中的果蠅”。Bae等應(yīng)用雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù)分析了擬南芥核蛋白在逆境脅迫下的變化，他們共檢測出500個(gè)點(diǎn)，鑒定了184個(gè)蛋白，其中與低溫脅迫相關(guān)的蛋白有40個(gè)，其中包括HSP90-like protein和60S ribosomal protein P2-A等。之后他們又選取了其中的6個(gè)點(diǎn)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，有4種蛋白僅存在于細(xì)胞核中。Yukio等在對低溫脅迫下擬南芥細(xì)胞膜蛋白質(zhì)的研究中發(fā)現(xiàn)，這些蛋白質(zhì)能提高細(xì)胞固定CO的能力，并且與細(xì)胞膜修復(fù)和膜的抗?jié)B透性都有關(guān)系。這說明了低溫脅迫下擬南芥中蛋白質(zhì)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是十分復(fù)雜的，還有待進(jìn)一步的研究。

2.2 蛋白質(zhì)組學(xué)在木本植物低溫脅迫中的研究

雖然目前關(guān)于木本植物低溫脅迫下蛋白質(zhì)組學(xué)的研究較少，但也取得了很大的進(jìn)展。在對楊樹蛋白低溫脅迫的研究過程中發(fā)現(xiàn)：伴侶蛋白、脫水蛋白、熱激蛋白、胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白以及硫氧化還原蛋白的表達(dá)量均會上調(diào)，而與能量代謝有關(guān)的蛋白則會受到抑制或下調(diào)表達(dá)，如ATP合成酶和參與糖代謝的酶。研究表明低溫會抑制楊樹生長，還可能引發(fā)萎黃病。因此，詳細(xì)了解低溫誘導(dǎo)蛋白合成機(jī)理，對提高植物對逆境抵抗能力及保證植物正常生長，提高作物產(chǎn)量有著重要的實(shí)際意義。

3 植物miRNA與其抗低溫脅迫的研究

MicorRNA(miRNA)是生物體內(nèi)具有調(diào)控功能的、內(nèi)源性的非編碼小RNA，通常有20～25個(gè)核苷酸(nt)組成。植物中的miRNA通過降解靶基因mRNA或抑制基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯來參與調(diào)控基因表達(dá)。它通常能與靶基因mRNA高度互補(bǔ)后與之結(jié)合，來完成對靶基因mRNA的降解作用。研究表明，miRNA在植物應(yīng)答非生物脅迫方面具有重要的調(diào)控作用，因此對于植物miRNA的研究受到了廣泛關(guān)注。目前已經(jīng)從水稻、擬南芥、冬小麥、玉米、蕨類、煙草、苔蘚和白楊等植物中發(fā)現(xiàn)了大量與低溫脅迫相關(guān)的miRNA。

3.1 水稻低溫脅迫下miRNA的研究

近些年來，研究者們做了許多實(shí)驗(yàn)來研究水稻miRNA在其非生物脅迫中的作用。對于在低溫脅迫下miRNA的研究主要通過生物信息學(xué)方法來完成。首選利用miRNA數(shù)據(jù)庫和靶基因預(yù)測軟件對水稻miRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測，然后根據(jù)水稻蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫和mRNA數(shù)據(jù)庫篩選出與低溫脅迫相關(guān)的靶mRNA序列，和其相對應(yīng)的就是與水稻低溫脅迫有關(guān)的miRNA，最后通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。目前，在水稻中發(fā)現(xiàn)的與低溫脅迫有關(guān)的miRNA主要有osa-miR164、osa-miR393、osa-miR396和osa-miR535。研究發(fā)現(xiàn)，在冷脅迫過程中osa-miR393持續(xù)上調(diào)表達(dá)，而osa-miR396是先上調(diào)在下降的，這說明與冷脅迫相關(guān)的miRNA其表達(dá)形式雖然不同，但都可以響應(yīng)冷脅迫。

3.2 擬南芥低溫脅迫下miRNA的研究

擬南芥miRNA是植物miRNA中研究的最早的，也是研究的最多的。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中miR393、miR397、miR171、miR172、miR169和miR408都可以在低溫下表達(dá)。并且同一種miRNA可以受多種因素調(diào)控，如低溫、干旱以及高鹽等非生物脅迫。其中miR171、miR172、miR169和miR408是通過降低生長素，從而提高擬南芥對低溫的抵御能力。

3.3 冬小麥低溫脅迫下miRNA的研究

冬小麥?zhǔn)俏覈饕募Z食作物，低溫會使冬小麥減產(chǎn)，對農(nóng)戶造成直接的經(jīng)濟(jì)損失。而對于冬小麥miRNA的研究，可以使我們了解冬小麥的抗寒機(jī)制，從而從基因?qū)用鎸ζ溥M(jìn)行調(diào)控。目前，在冬小麥中發(fā)現(xiàn)的miR156、miR160、miR398和miR444b經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，證實(shí)與冬小麥低溫脅迫有關(guān)。并且發(fā)現(xiàn)前三種miRNA在擬南芥中也能響應(yīng)低溫脅迫，而miR444b在擬南芥中沒有檢測到，這說明了miRNA有一定的特異性。

4 結(jié)語

低溫脅迫作為非生物脅迫中重要的一員，引起了研究者的廣泛關(guān)注，并且從各個(gè)方面對植物低溫脅迫進(jìn)行了研究。雖然目前對植物低溫脅迫機(jī)理的研究已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，但這僅限于幾種模式植物，如水稻和擬南芥等。同時(shí)對其具體的生理過程了解的還不是很透徹，需要進(jìn)一步研究。并且目前所做的研究大多是在實(shí)驗(yàn)室人工模擬的條件下進(jìn)行的，對于其是否能與實(shí)際生產(chǎn)相匹配還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。