李瑞姿+林軍+汪廈霞+俞曉敏+陳燦理+關(guān)躍峰

[摘要] 金線蓮是傳統(tǒng)的中藥及保健品，其人工栽培分為組織培養(yǎng)和土壤栽培2個(gè)階段，但后者對于金線蓮保健功能成分的積累是否必要尚缺乏定論。該研究以組培至壯苗及組培壯苗后再經(jīng)3個(gè)月土壤栽培的金線蓮為試驗(yàn)材料，利用GC-TOF-MS和UPLC-Q-TOF-MS對其代謝成分進(jìn)行非靶向分析，找出了2個(gè)栽培階段的差異代謝成分。結(jié)果表明，初級代謝產(chǎn)物中的醇類及有機(jī)酸等，在組培苗中含量較高。而寡糖、核苷類、酯類及次級代謝產(chǎn)物中黃酮類、萜類化合物含量在栽培苗中有明顯提高。黃酮類和多糖被認(rèn)為是金線蓮的主要活性成分，因此土壤栽培對其有益成分的積累十分必要，經(jīng)土壤栽培金線蓮藥用價(jià)值更高。

[關(guān)鍵詞] 金線蓮； 代謝組； 組培； 栽培； GC-TOF-MS； UPLC-Q-TOF-MS

[Abstract] Anoectochilus roxburghii is a traditional Chinese medicine and natural health products. In the modern cultivation system， A. roxburghii is micropropagated in tissue culture， and the plants are transferred to soil cultivation for months. However， it remains unclear about the necessity of soil cultivation for the accumulation of health beneficial compounds. In this paper， we performed nontargeted metabolomic analysis using GC-TOF-MS and UPLC-Q-TOF-MS， on A. roxburghii plants at tissue culture stage or after 3 months of soil cultivation. The results showed that the primary metabolites such as alcohols and organic acids are abundant in the tissue culture plants. In contrast， polysaccharide， nucleoside， esters and secondary metabolites such as flavonoids， terpenoids were significantly accumulated in cultivated seedlings. Flavonoids and polysaccharides are considered as the principle effective components in A. roxburghii. Soil cultivation period is therefore essential for the accumulation of these metabolites.

[Key words] Anoectochilus roxburghii； metabolomics； tissue culture； soil cultivation； GC-TOF-MS； UPLC-Q-TOF-MS

金線蓮Anoectochilus roxburghii（Wall.）Lindl為蘭科開唇蘭屬多年生草本植物。該植物主要分布中國南部地區(qū)，系閩臺民間特色中藥，多用于腎炎、支氣管炎、膀胱炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、小兒急驚風(fēng)、毒蛇咬傷等癥[1-2]。藥理活性分析表明，金線蓮具有抗腫瘤，降血糖，保肝，抗HBV，降血壓等活性[3-7]，藥用價(jià)值和保健功能顯著，市場價(jià)值極高。同時(shí)其株型小巧，葉型優(yōu)美，葉脈金黃色，呈網(wǎng)狀排列，是觀賞價(jià)值極高的室內(nèi)觀葉珍品[8]。迄今為止，已從金線蓮中分離出了多種化學(xué)成分，主要有多糖、氨基酸、生物堿、皂苷、甾體、有機(jī)酸、黃酮等成分，且8種必需氨基酸的含量很高，有很好的提高機(jī)體免疫力的作用，多糖和黃酮類物質(zhì)被推測為其主要活性成分[9-13]。

隨著人們生活水平的提高，金線蓮的市場需求不斷擴(kuò)大。傳統(tǒng)金線蓮產(chǎn)品需經(jīng)組培至壯苗后土壤栽培3～5個(gè)月上市。但組培壯苗與3～5月土壤栽培苗在形態(tài)上并無明顯差異，因此對于繼續(xù)土壤栽培的必要性存有爭議，但目前還未有合適的體系來對不同栽培階段的金線蓮品質(zhì)進(jìn)行評估。土壤栽培是否有助于金線蓮中有效成分的積累仍未清楚，其不同栽培階段的代謝組分差異更是無人研究。本試驗(yàn)首次在金線蓮研究中采用代謝組學(xué)的方法對不同栽培階段金線蓮的代謝組分進(jìn)行非靶向分析，以期發(fā)現(xiàn)它們之間代謝成分的差異，揭示其品質(zhì)最佳的栽培階段，為合理開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

1 材料

氣相色譜質(zhì)譜儀器安捷倫（Agilent）7890B氣相色譜，GERSTEL MPS自動(dòng)進(jìn)樣架，LECO Pegasus HT飛行時(shí)間質(zhì)譜（Time-of-Flight Mass Spectrometer）；毛細(xì)管色譜柱RESTEK Rxi-5 Sil MS（0.25 μm × 0.25 mm ×30 m）。液相色譜質(zhì)譜儀器Waters UPLC-Q-TOF I-class液相色譜，Waters SYNAPT G2-Si HDMS質(zhì)譜；色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm ×100 mm，1.8 μm）。恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器（昆山，型號KQ-300GDV）；分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司 d=0.1mg）；純水系統(tǒng)（Manufacturer milipore，型號Elix Essential 5，Milli-Q Advantage A10）；冷凍干燥機(jī)（LABCONCO，型號7754070）；CentriVap離心濃縮儀（LABCONCO，型號7812038）。endprint

甲醇（質(zhì)譜純，購于Sigma Aldrich），氯仿（色譜純，購于泰京），甲酸（質(zhì)譜純，購于Sigma Aldrich），乙腈（質(zhì)譜純，購于Sigma Aldrich）；核糖醇（購于Sigma Aldrich）；甲氧胺（購于Sigma Aldrich）；吡啶（購于Sigma Aldrich）；BSTFA+1%TMCS（購于SUPELCO）；耗材均為代謝成分檢測專用。

金線蓮A. roxburghii由福州新奧生物技術(shù)有限公司提供。樣品類型為：即將出瓶的組培期金線蓮苗（TC），出瓶后經(jīng)土壤栽培3個(gè)月的栽培期金線蓮苗（SC）。

2 方法

2.1 培養(yǎng)信息

培養(yǎng)基的配制和分裝：1/2MS為基本培養(yǎng)基，加入6-BA 2 mg·L-1，NAA 1.0 mg·L-1，蕓苔素0.05 mg·L-1，香蕉100 g·L-1，瓊脂粉6.5 g·L-1，糖25 g·L-1，pH 5.6～5.8，均勻分裝于干凈的培養(yǎng)瓶并加蓋，120 ℃，105 kPa 20 min滅菌，及時(shí)取出冷卻備用。

2.2 外植體處理和接種

10%的次氯酸鈉消毒15 min后的莖段在無菌條件下切成長約1 cm含1個(gè)莖節(jié)的若干段，接種于上述培養(yǎng)基上。移入培養(yǎng)間，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx，培養(yǎng)4個(gè)月左右。

2.3 移栽

選高6～8 cm具3片葉以上，莖基直徑約2 mm，根2～3條的瓶苗（即TC），先移出培養(yǎng)間放自然光照培養(yǎng)4～6 d后，洗凈附著在植株上的培養(yǎng)基，晾干后移栽至1份菜園土+2份粗沙+1份木屑的基質(zhì)中自然狀態(tài)下栽培3個(gè)月（即SC）。

2.4 氣相色譜參數(shù)

進(jìn)樣量1 μL，進(jìn)樣口溫度230 ℃，不分流進(jìn)樣模式，載氣為氦氣，氣體純度99.999 5%以上，流速2 mL·min-1。柱溫箱初始溫度80 ℃，保持2 min，以15 ℃·min-1升至330 ℃，保持6 min。傳輸線溫度275 ℃。

質(zhì)譜參數(shù)為離子源溫度250 ℃，質(zhì)量掃描范圍是m/z 45～500，采集速率每秒10個(gè)掃描，溶劑延遲240 s，檢測器電壓為1 460 V，燈絲偏置電流為70 eV。數(shù)據(jù)處理采用LECO-Chroma TOF 軟件（Software Version 4.5x，Part Number 200-999-014）。

2.5 液相色譜參數(shù)

進(jìn)樣量1 μL，檢測波長190～700 nm；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A），0.1%甲酸乙腈溶液（B）。梯度洗脫，0～5 min，100%～95%（A）；5～7.5 min，95%～85%（A）；7.5～30 min，85%～15%（A）；30～36 min，15%～0%（A）；36～52 min，0%（A）；52～53 min，0%～100%（A）；53～56 min，100%（A）；流速0.3 mL·min-1；柱溫40 ℃。

質(zhì)譜參數(shù)為電噴霧電離源（ESI），正負(fù)離子掃描模式；MSE數(shù)據(jù)采集模式，碰撞能量范圍10～50 eV；質(zhì)譜掃描質(zhì)核比范圍m/z 50～1 200；質(zhì)量數(shù)校正物質(zhì)亮氨酸腦啡肽；毛細(xì)管電壓2.0 kV；離子源溫度為120 ℃；脫溶劑氣溫450 ℃；脫溶劑氣體流速800 L·h-1；進(jìn)樣錐錐孔氣體流速50 L·h-1；錐孔電壓40 V；錐孔補(bǔ)償電壓80 V；霧化氣壓力6.5 bar；掃描時(shí)間0.2 s。

液相色譜質(zhì)譜譜圖解卷積及代謝物定性軟件為Progenesis QI 軟件（Software Version 2.2），參數(shù)設(shè)置使用軟件默認(rèn)值。Umetrics EZinfo 3.0 for waters，MassLynx v4.1。

2.6 樣品的制備

2.6.1 氣相色譜質(zhì)譜檢測樣品的制備 干凈新鮮的金線蓮全株，液氮研磨。研磨好的樣品于凍干機(jī)上冷凍干燥48 h至完全干燥。稱取20 mg凍干樣品于2.0 mL離心管中，加入1.4 mL預(yù)冷的甲醇，搖勻。加入10 μL內(nèi)標(biāo)物核糖醇（1 g·L-1），混勻。70 ℃，950 r·min-1，震蕩10 min。11 000×g離心10 min。吸800 μL上清于5 mL離心管中，加入750 μL預(yù)冷的氯仿，搖勻。加入1.4 mL預(yù)冷的雙蒸水，渦旋搖勻。2 200 g離心15 min。吸取500 μL上清到2 mL樣品瓶中，真空濃縮至完全干。同時(shí)制備QC，根據(jù)樣品數(shù)計(jì)算所需QC個(gè)數(shù)，確保每5個(gè)上機(jī)檢測樣品檢測1個(gè)QC，精確吸取適量每個(gè)待上機(jī)檢測樣品的上清到2 mL樣品瓶中充分混勻，真空濃縮至完全干。向濃縮好的樣品中加入80 μL甲氧胺吡啶溶液（15 g·L-1，現(xiàn)配現(xiàn)用），37 ℃搖床，200 r·min-1，衍生化2 h。再加入80 μL BSTFA+1%TMCS，混勻，37 ℃搖床，200 r·min-1，衍生化30 min。吸取衍生化好的樣品150 μL到裝有內(nèi)襯管的樣品瓶中，每個(gè)分析樣本做5個(gè)生物學(xué)重復(fù)，上機(jī)檢測。

2.6.2 液相色譜質(zhì)譜檢測樣品的制備 稱取30 mg凍干樣品于2.0 mL離心管中，加入70%甲醇水溶液，渦旋混勻。25 ℃超聲萃取20 min。12 000×g離心10 min。取15 μL上清至新的1.5 mL離心管中并用70%的甲醇水溶液稀釋10倍，混勻。取上述制備好的樣品150 μL于裝有內(nèi)襯管的2.0 mL樣品瓶中，每個(gè)分析樣本做5個(gè)生物學(xué)重復(fù)，上機(jī)檢測。

3 結(jié)果與討論

3.1 不同階段金線蓮差異初級代謝產(chǎn)物的鑒定

GC-MS數(shù)據(jù)用LECO-Chroma 多元統(tǒng)計(jì)分析，共從極性的水相和非極性的氯仿相中檢測到329個(gè)色譜峰。色譜峰通過與NIST和Fiehn數(shù)據(jù)庫比對，以相似度大于700推斷性定性，并結(jié)合已有標(biāo)樣，共鑒定出160個(gè)化合物，主要為糖類、氨基酸、有機(jī)酸、醇類等。SIMCA-P+（Version 11.0）分析得到供試樣品在2種栽培階段下代謝物的PCA結(jié)果分值圖，在第一主成分PC1（76.16%）和第二主成分PC2（19.42%）的分值圖上，2種栽培階段的樣品呈現(xiàn)明顯分離（圖1）。說明金線蓮在不同栽培階段代謝成分上存在很大差異。endprint

差異代謝物尋找需要滿足以下3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)：OPLS-DA模型中VIP>1，SPSS（IBM SPSS Statistics 22）非參數(shù)檢驗(yàn)的P<0.05，QC RSD>40%，供試樣品中差異代謝物有22個(gè)，鑒定出12個(gè)可作為快速區(qū)分2個(gè)栽培階段金線蓮初級代謝標(biāo)識物（表1，2）。差異代謝物中TC高于SC的主要為有機(jī)酸和醇類，如丙酮酸差異倍數(shù)為22.6，蘋果酸為6.1。SC中含量較高的主要為糖及其衍生物，其中麥芽糖差異倍數(shù)為9.93，蔗糖為3.1。

3.2 不同階段金線蓮苗差異次級代謝產(chǎn)物的鑒定

金線蓮中的藥效成分目前被認(rèn)為是黃酮、多糖等物質(zhì)，本研究用UPLC-Q-TOF-MS分析檢測樣品次級代謝物。UPLC-Q-TOF-MS原始數(shù)據(jù)經(jīng)Progenesis QI峰提取，峰對齊，歸一化處理，ESI-共提取出4 051個(gè)色譜峰，ESI+共提取出5 460個(gè)色譜峰。在ESI 2種模式下，PCA分析（Umetrics EZinfo 3.0 for waters）顯示，TC和GC呈現(xiàn)明顯分離（圖2）。

色譜峰通過與HMDB和ChemSpider數(shù)據(jù)庫比對，以碎片匹配度（實(shí)際與理論）得分越接近100，質(zhì)量數(shù)偏差越接近0，同位素豐度相似度越接近100，結(jié)合MassLynx v4.1軟件及文獻(xiàn)查閱推斷定性，ESI-檢測到1 211個(gè)信號，ESI+檢測到3 134個(gè)信號，主要為黃酮糖苷類、酯類、萜類、有機(jī)酸、生物堿、甾醇等。差異代謝物尋找通過4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)：PCA模型中VIP>1，QI非參數(shù)檢驗(yàn)的P<0.05，CV>30，差異倍數(shù)在兩倍以上。最終找到差異代謝物83種，其中SC含量較高的物質(zhì)有47種（表3），其中糖類化合物maltohexaose，maltopentaose差異倍數(shù)分別再67.12，59.01，生物堿如Alkaloid RC、Laurelliptine，SC中含量分別是TC的13.86，7.05倍，黃酮類化合物如rutin差異倍數(shù)為17.96，emodinanthranol差異倍數(shù)為35.18，甾醇如lucidone C差異倍數(shù)為190.65，這些物質(zhì)都可作為區(qū)分2種栽培階段金線蓮的標(biāo)識物，其中有些還是潛在的藥用功能成分。TC含量較高的物質(zhì)有36種（表4），變化較大的主要是有機(jī)酸如（R）-2-hydroxyhexadecanoic acid和3-dehydrosphinganine，差異倍數(shù)分別為9.23和7.98，另外葉黃素idoxanthin，TC中含量是SC的79.98倍。這些物質(zhì)可以認(rèn)為是區(qū)分2種栽培階段金線蓮的代謝標(biāo)識物。

3.3 討論

代謝物作為細(xì)胞調(diào)控過程的終產(chǎn)物，它們的種類和數(shù)量的變化被視為植物對基因或環(huán)境變化的最終響應(yīng)，對這些化合物在動(dòng)態(tài)、靜態(tài)上進(jìn)行全面地定性定量分析，即代謝組學(xué)研究。自1998年提出代謝組的概念以來，代謝組學(xué)發(fā)展迅速，受到各領(lǐng)域的廣泛重視，具有廣泛的應(yīng)用前景。植物代謝組學(xué)作為代謝組學(xué)的重要組成部分，已逐步應(yīng)用于基因功能的研究、代謝途徑及代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制的解析等基礎(chǔ)生物學(xué)的研究中[14-16]；也開始應(yīng)用于作物的產(chǎn)量、營養(yǎng)成分等育種領(lǐng)域中[14]。代謝組學(xué)研究中，氣相色譜適用于分析容易氣化的低極性、低沸點(diǎn)代謝物，如各類揮發(fā)性化合物；或者衍生化后低沸點(diǎn)的物質(zhì)，主要為初級代謝產(chǎn)物，單獨(dú)使用GC-MS還不能全面揭示植物所有代謝物的變化。同GC相比，LC不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的影響，樣品前處理非常簡單，過濾后可以直接進(jìn)樣。因此，LC-MS可有效分析植物中豐富的次生代謝產(chǎn)物。在眾多的質(zhì)譜類型中，高分辨率的串聯(lián)四級桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（quadrupole time-of-flight nass spectrometer，Q-TOF-MS）能最大程度地滿足植物代謝組學(xué)研究的需要，LC-Q-TOF-MS已成功應(yīng)用與番茄的代謝組學(xué)研究中[17]，系統(tǒng)地分析了番茄中中等極性的代謝物，結(jié)合保留時(shí)間、準(zhǔn)確質(zhì)量、紫外光譜和二級質(zhì)譜信息，建立了番茄的代謝物數(shù)據(jù)庫MoTo DB[18]。運(yùn)用代謝組學(xué)的研究手段，采用GC-TOF-MS與UPLC-Q-TOF-MS相結(jié)合全面分析金線蓮中的代謝物，為未知成分鑒定提供可能。

通過對金線蓮代謝組學(xué)的初步研究，結(jié)果顯示部分有機(jī)酸在TC中明顯高于SC，這可能是由于組培苗生長環(huán)境優(yōu)越及培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，使得金線蓮初級代謝旺盛所致。金線蓮苗移栽至土壤中之后，營養(yǎng)成分來源減少，初生代謝減弱，故SC與TC在形態(tài)上并無差異。UPLC-Q-TOF-MS分析結(jié)果顯示，SC金線蓮全株次級代謝產(chǎn)物的積累相對于TC有很大的提高。如：isorhamnetin，rutin，isorhamnetin triglucopyranoside，quercetin-3，4′-diglucoside，quercitrin，kaempferol-3-O-glucosyl-（1→2）-rhamnoside等黃酮及黃酮糖苷類化合物，研究表明這類化合物具有抗敏、抗炎、防止惡性細(xì)胞擴(kuò)散及抗癌的特性[19-20]。nicotinamide riboside作為人體NAD+的前體物質(zhì)，NAD+有助于抵抗神經(jīng)系統(tǒng)降解、滑念珠菌感染及提高膽固醇逆向運(yùn)輸[21]。值得一提的是，hemorphin-4在組培金線蓮中含量較高，這可能是除異亮石松堿之外金線蓮中又一具有陣痛特性的成分[22]。由此推測，在組培壯苗出瓶后，繼續(xù)進(jìn)行土壤栽培，能夠促使金線蓮中黃酮等物質(zhì)的累積。由于上述黃酮等物質(zhì)比起有機(jī)酸等物質(zhì)具有更高的藥用價(jià)值，因此認(rèn)為組培后再經(jīng)土壤栽培的金線蓮的品質(zhì)更加優(yōu)異。

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[責(zé)任編輯 丁廣治]endprint