鄺彤東+陳惠琴+李薇+楊錦玲+周麗曼+蔡彩虹+董文化+梅文莉+戴好富

[摘要] 運(yùn)用多種色譜技術(shù)，對(duì)人工打洞沉香乙醇提取物的正丁醇相進(jìn)行化學(xué)成分分離，并根據(jù)波譜數(shù)據(jù)結(jié)合理化性質(zhì)共鑒定了7個(gè)單體化合物的結(jié)構(gòu)，分別為selina-3，11-dien-9，15-diol （1）、aquilarone D （2）、5α，6β，7α，8β-tetrahydroxy- 2-[2-（2-hydroxyphenyl）ethyl]-5，6，7，8-tetrahydrochromone （3）、6，7-dimethoxy-2- [2-（4-methoxyphenyl）ethyl]chromone （4）、syringin （5）、順式對(duì)羥基肉桂酸甲酯 （6）和4′-甲氧基肉桂酸 （7），其中化合物1為新的倍半萜類(lèi)化合物，化合物5～7為首次從沉香中分離得到。生物活性測(cè)試結(jié)果表明化合物6，7對(duì)全齒復(fù)活線蟲(chóng)具有較好的致死活性，化合物4，6，7對(duì)人肝癌細(xì)胞株BEL-7402、人胃癌細(xì)胞株SGC-7901和人肺癌細(xì)胞株A549的生長(zhǎng)有不同程度的抑制作用。

[關(guān)鍵詞] 沉香； 正丁醇相； 倍半萜； 生物活性

[Abstract] In order to study the chemical constituents of n-butanol fraction of ethanol extract from Chinese agarwood induced by artificial holing， various chromatographic techniques were carried out to isolate compounds， and the structures of compounds were determined through a combined analysis of physicochemical properties and spectroscopic evidence. Seven compounds were obtained and identified as selina-3，11-dien-9，15-diol （1）， aquilarone D （2）， 5α，6β，7α，8β-tetrahydroxy-2-[2-（2-hydroxyphenyl）ethyl]-5，6，7，8-tetrahydrochromone （3）， 6，7-dimethoxy-2-[2-（4-methoxyphenyl）ethyl]chromone （4）， syringin （5）， methyl （Z）-p-coumarate （6）， and 4′-methoxycinnamic acid （7）， among which compound 1 was a new compound and compounds 5-7 were isolated from agarwood for the first time. The bioactivity assay results concluded that compounds 6 and 7 showed certain nematicidal activity against Panagrellus redivivus， and compounds 4， 6 and 7 exhibited cytotoxicity against BEL-7402， SGC-7901 and A549 carcinoma cell lines.

[Key words] agarwood； n-butanol extract； sesquiterpene； biological activity

沉香為瑞香科Thymelaeceae沉香屬Aquilaria或擬沉香屬Gyrinops植物受傷后產(chǎn)生的含樹(shù)脂的干燥芯材[1]。白木香A. sinensis （Lour.）Gilg為我國(guó)特有的沉香基原植物，主要生長(zhǎng)于海南、福建、廣東、廣西等地區(qū)[2]。沉香入藥已有兩千多年歷史，其味辛、苦，性微溫，具有降氣溫中，暖腎納氣的功效[3-4]?，F(xiàn)代藥理研究表明，沉香在抗腫瘤、降血脂、抗菌消炎、鎮(zhèn)靜安神等[5-9]方面具有一定的作用。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，沉香的特征性化學(xué)成分為多種骨架類(lèi)型的倍半萜和2-（2-苯乙基）色酮類(lèi)化合物[10]，目前相關(guān)研究主要集中于野生沉香，而針對(duì)人工沉香的研究相對(duì)缺乏。隨著野生沉香資源變得日益匱乏，人工沉香能否代替野生沉香的問(wèn)題變得尤為重要，所以本課題對(duì)人工沉香重要來(lái)源之一的人工打洞沉香進(jìn)行深入研究。

本研究組前期從國(guó)產(chǎn)人工打洞沉香的乙酸乙酯相分離鑒定了一系列結(jié)構(gòu)新穎并具有一定生物活性的化合物[11-12]。在此基礎(chǔ)上，本研究首次針對(duì)國(guó)產(chǎn)人工打洞沉香的正丁醇相進(jìn)行化學(xué)成分研究，從中分離鑒定了7個(gè)單體化合物（圖1），其中化合物1為新的倍半萜類(lèi)化合物。結(jié)合人工打洞沉香乙酸乙酯相與正丁醇相分離得到的化合物，可以為更好地評(píng)價(jià)人工打洞沉香的品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

安捷倫1260分析型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；戴安SUMMITP680A半制備高效液相色譜儀（美國(guó)戴安公司）；HR-ESI-MS質(zhì)譜儀（瑞士布魯克公司）；ESI-MS質(zhì)譜儀（瑞士布魯克公司）；布魯克AV-500核磁共振波譜儀（瑞士布魯克公司）；ELX-800酶標(biāo)儀（美國(guó)寶特公司）；薄層色譜硅膠板和柱色譜硅膠（青島海洋化工廠）；Sephadex LH-20（德國(guó)默克公司）；D101型大孔吸附樹(shù)脂（山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司）；N-1000（2L）立式旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛(ài)朗儀器有限公司）；超純水裝置（廈門(mén)銳思捷水純化技術(shù)有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；1/1萬(wàn)電子秤（北京賽多利斯天平有限公司）；濃硫酸（淄博濱嶺化工有限公司）；核磁共振用氘代試劑（德國(guó)默克公司）；常用AR級(jí)試劑購(gòu)買(mǎi)自廣州化工和天津大茂等公司；色譜純?cè)噭┵?gòu)買(mǎi)于天津四友和天津康科德等公司；紫杉醇購(gòu)于江蘇紅豆杉藥業(yè)有限公司；人肝癌細(xì)胞株BEL-7402、人胃癌細(xì)胞株SGC-7901和人肺癌細(xì)胞株A549均購(gòu)于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心細(xì)胞庫(kù)。endprint

結(jié)香4年人工打洞沉香（4.7 kg）于2012年11月采自云南省西雙版納傣族自治州，經(jīng)中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所代正福副研究員鑒定其基源植物為白木香A. sinensis，樣本保存在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所（標(biāo)本編號(hào)AW20121108）。

2 提取與分離

人工打洞沉香樣品（4.7 kg）粉碎后用95%乙醇（15.0 L）回流提取3次，減壓濃縮得到浸膏（510.0 g）。隨后將浸膏分散至水中，用乙酸乙酯和正丁醇依次萃取3次。濃縮后將正丁醇相浸膏（199.0 g）經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂D101吸附后用甲醇洗脫濃縮得浸膏92.0 g，再將該浸膏經(jīng)減壓硅膠柱色譜進(jìn)行分離，以氯仿-甲醇系統(tǒng)（1∶0～0∶1）梯度洗脫，濃縮后經(jīng)TLC薄層色譜檢測(cè)，合并顯色劑顯色和Rf相同的部分，得10個(gè)流分（Fr.1～10）。Fr. 2（氯仿-甲醇80∶1洗脫流分，2.5 g）先經(jīng)RP-18柱色譜以甲醇-水（2∶3～1∶0）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，得到9個(gè)流分（Fr.2.1～2.9）。Fr.2.3（甲醇-水2∶3洗脫流分，189.0 mg）經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離，以甲醇為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫得3個(gè)流分（Fr.2.3.1～2.3.3）。Fr.2.3.2（87.8 mg）再經(jīng)硅膠柱色譜以石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)（100∶1，20∶1，10∶1，3∶1）為流動(dòng)相洗脫得4個(gè)流分（Fr.2.3.2.1～2.3.2.4）。Fr.2.3.2.2（石油醚-乙酸乙酯100∶1洗脫流分，16.2 mg）再經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離，以石油醚-氯仿-甲醇（2∶1∶1）系統(tǒng)為流動(dòng)相洗脫得2個(gè)流分（Fr.2.3.2.2.1～2.3.2.2.2）。Fr.2.3.2.2.2（10.2 mg）經(jīng)半制備型HPLC（C18柱；45%甲醇-水系統(tǒng)為流動(dòng)相；流速4 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm）分離得化合物6（3.0 mg）和7（3.6 mg）。Fr.2.4（甲醇-水1∶1洗脫流分，53.0 mg）經(jīng)半制備HPLC（C18柱；30%乙腈-水系統(tǒng)為流動(dòng)相；流速4 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm）分離得化合物1（1.5 mg）。Fr.2.6（甲醇-水3∶2洗脫流分，585.0 mg）有白色固體析出，用甲醇重結(jié)晶后其母液部分濃縮得471.1 mg，經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜以甲醇為流動(dòng)相洗脫得4個(gè)流分（Fr.2.6.1～2.6.4）。Fr.2.6.2（118.0 mg）經(jīng)半制備HPLC（C18柱；45%甲醇-水系統(tǒng)為流動(dòng)相；流速4 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm）分離得化合物4（4.7 mg）。

Fr.8（氯仿-甲醇5∶1洗脫流分，14.9 g）首先經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜以甲醇作為流動(dòng)相除去色素，剩余樣品（11.9 g）經(jīng)RP-18柱色譜以甲醇-水（2∶3～1∶0）系統(tǒng)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，得9個(gè)流分（Fr.8.1～8.9）。Fr.8.1（甲醇-水2∶3洗脫流分，441.5 mg）經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離，以甲醇為流動(dòng)相洗脫得4個(gè)流分（Fr.8.1.1～8.1.4）。Fr.8.1.2（21.3 mg）經(jīng)硅膠柱色譜，以石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)（1∶10）洗脫得3個(gè)流分（Fr.8.1.2.1～8.1.2.3）。Fr.8.1.2.2（石油醚-乙酸乙酯1∶10洗脫流分，4.6 mg）經(jīng)過(guò)半制備HPLC（C18柱；30%甲醇-水系統(tǒng)為流動(dòng)相；流速4 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm）分離得化合物5（3.4 mg）。Fr.8.1.4（164.8 mg）經(jīng)硅膠柱色譜以氯仿-甲醇系統(tǒng)（30∶1，25∶1，10∶1）為流動(dòng)相洗脫得4個(gè)流分（Fr.8.1.4.1～8.1.4.4）。Fr.8.1.4.2（氯仿-甲醇25∶1洗脫流分，12.9 mg）經(jīng)半制備HPLC（C18柱；30%甲醇-水系統(tǒng)為流動(dòng)相；流速4 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm）分離得化合物2（2.8 mg）。Fr.8.2（甲醇-水2∶3洗脫流分，6.3 g）取部分樣品（135.0 mg），直接經(jīng)半制備HPLC（C18柱；30%甲醇-水系統(tǒng)為流動(dòng)相；流速4 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm）分離得化合物3（2.2 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 黃色油狀物（CHCl3）；HR-ESI-MS m/z 259.166 6[M+Na]+（計(jì)算值為259.166 9），結(jié)合1H-NMR和13C-NMR 數(shù)據(jù)，確定其分子式為C15H24O2，不飽和度為4?；衔锏?H-NMR（CDCl3，500 MHz）譜中呈現(xiàn)2個(gè)甲基單峰信號(hào)δH 1.76（3H，s）和0.80（3H，s），3個(gè)烯氫信號(hào)δH 4.73（1H，br s），4.74（1H，br s）和5.67（1H，s），3個(gè)連氧碳上的氫信號(hào)δH 3.40（1H，dd，J=11.4，4.5 Hz），3.98（1H，d，J=12.3 Hz）和4.12（1H，d，J=12.5 Hz）。化合物的13C-NMR（DEPT）譜中顯示有15個(gè)碳信號(hào)，其中包含4個(gè)雙鍵碳信號(hào)，其余的碳信號(hào)中含有2個(gè)甲基碳（δC 20.9和10.1），5個(gè)亞甲基碳（δC 22.4，27.5，32.8，35.1，65.9）包含1個(gè)連氧碳，3個(gè)次甲基碳（δC42.9，43.6，78.0）包含1個(gè)連氧碳，1個(gè)季碳（δC37.6）。通過(guò)上述分析，并與文獻(xiàn)[13]中的化合物（5S，7S，9S，10S）-（+）-selina-3，11-dien-9-ol對(duì)比，發(fā)現(xiàn)兩者差別僅在于已知化合物的14位甲基被氧化為羥甲基，即已知化合物的14位信號(hào)[δH 1.63（3H，s）； δC 21.7]被化合物1中的信號(hào)[δH 4.12（1H，d，J=12.5 Hz，H-14a），3.98（1H，d，J=12.3 Hz，H-14b）； δC 65.9]所取代，所以該化合物也推斷為桉烷型骨架的倍半萜。另外根據(jù)二維波譜數(shù)據(jù)（圖2），在HMBC譜中，H2-14與C-3，C-4，C-5有相關(guān)，進(jìn)一步證明了14位羥甲基的存在；H-12與C-7，C-11，C-13有相關(guān)，H-13與C-7，C-11，C-12有相關(guān)，表明異丙烯基的存在，并連接在C-7位上。再結(jié)合HSQC和1H-1H COSY相關(guān)譜推導(dǎo)出化合物1的結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2。1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ： 5.67（1H，s，H-3），4.74（1H，br s，H-12a），4.73（1H，br s，H-12b），4.12（1H，d，J=12.5 Hz，H-14a），3.98（1H，d，J=12.3 Hz，H-14b），3.40（1H，dd，J=11.4，4.5 Hz，H-9），2.07-2.11（4H，m，H-2a，2b，5，7），1.93～1.96（1H，m，H-1a），1.85（2H，m，H-6a，8a），1.76（3H，s，H-13），1.58（1H，J=11.7 Hz，H-8b），1.25（1H，m，H-1b），1.21（1H，m，H-6b），0.80（3H，s，H-15）； 13C-NMR（CDCl3，125 MHz）δ： 32.8（C-1），22.4（C-2），124.3（C-3），137.4（C-4），43.6（C-5），27.5（C-6），42.9（C-7），35.1（C-8），78.0（C-9），37.6（C-10），149.2（C-11），109.2（C-12），20.9（C-13），65.9（C-14），10.1（C-15）。綜上所述，化合物1的結(jié)構(gòu)鑒定為selina-3，11-dien-9，15-diol，經(jīng)查閱文獻(xiàn)，該化合物為新化合物。endprint

4 生物活性測(cè)試

采用貝曼漏斗法[20]和MTT法[21]分別測(cè)定了化合物1～7全齒復(fù)活線蟲(chóng)致死活性和細(xì)胞毒活性（表3）。

5 結(jié)果與討論

本研究組前期對(duì)人工打洞沉香的乙酸乙酯相進(jìn)行化學(xué)成分研究，從中分離鑒定了76個(gè)化合物，其中18個(gè)倍半萜類(lèi)化合物，50個(gè)2-（2-苯乙基）色酮類(lèi)化合物和8個(gè)其他類(lèi)化合物[11-12]。在此基礎(chǔ)上，本研究通過(guò)多種柱色譜技術(shù)首次對(duì)人工打洞沉香正丁醇萃取相的化學(xué)成分進(jìn)行研究，分離得到7個(gè)化 合物，其中1個(gè)新倍半萜類(lèi)化合物（1），3個(gè)2-（2-苯乙基）色酮類(lèi)化合物（2～4），3個(gè)苯丙素類(lèi)化合物（5～7），其中化合物5～7為首次從沉香中分離得到。生物活性測(cè)試結(jié)果顯示化合物6和7對(duì)全齒復(fù)活線蟲(chóng)具有較好的致死活性，化合物4和6分別對(duì)人肝癌細(xì)胞BEL-7402、人胃癌細(xì)胞SGC-7901和人肺癌細(xì)胞A549的生長(zhǎng)均有一定的抑制作用，化合物7對(duì)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901的生長(zhǎng)有較弱的抑制活性。研究結(jié)果為沉香的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。

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[責(zé)任編輯 丁廣治]endprint