魏藝聰+蔣超+袁媛+趙玉洋+金艷+黃璐琦

[摘要] 為了建立梅花鹿、馬鹿及其雜交鹿茸的特異性PCR鑒別方法。采集不同來源的梅花鹿、馬鹿鹿及其雜交鹿的鹿角或鹿茸樣品共48份，其中24份為市場流通的待測樣品。分別利用COI與SRY基因序列作為其父母本的鑒別標記，對已知樣品的COI與SRY基因進行擴增、測序，進行同源比對后根據(jù)其變異位點設(shè)計特異鑒別引物，分別基于COI與SRY基因建立對梅花鹿、馬鹿及其雜交鹿的鹿茸的特異PCR鑒定方法，并隨機對市場流通的24份待測鹿茸樣品進行鑒別分析。該實驗所構(gòu)建雙位點特異PCR體系，基于COI的鑒別位點，可通過PCR擴增獲得232 bp的梅花鹿特異片段，而產(chǎn)生518 bp的馬鹿特異片段；而基于SRY的鑒別位點，通過PCR擴增獲得803 bp的梅花鹿特異片段，而產(chǎn)生425 bp的馬鹿特異片段。隨機抽取市場流通中的24個待測鹿茸樣品，經(jīng)鑒定有3個樣品屬于馬·花雜交的鹿茸樣品。該實驗建立對梅花鹿、馬鹿及其雜交鹿的鹿茸的PCR鑒別方法簡便、可靠。

[關(guān)鍵詞] 梅花鹿； 馬鹿； 雜交； 雙位點特異PCR體系； COI； SRY

[Abstract] For rapid identification of Cervus nippon， C. elaphus and their hybridize samples， the specific PCR for mutual authentication of them was established based on the SNPs in COI and SRY sequence. C. nippon， C. elaphus and their hybridize samples were collected from different origins， total DNA of 24 identified samples were extracted， and the COI and SRY gene was seqenced. SNPs in the COI and SRY sequences of the samples were found by Clustul X 2.1 program. Primers for identifying C. nippon and C. elaphus were designed according to the SNP site， two multi-PCR reaction system were established to identify them. In addition， 24 samples which were randomly collected in different herbal medicine market were identified. The band special for C. nippon （232 bp）and band special for C. elaphus （518 bp） based on COI sequence，and the band special for C. nippon （803 bp）and band special for C. elaphus （425 bp） based on SRY sequence， were found using multi-PCR reaction， and three of the twenty-four samples were identified as the hybridize samples. The multi-PCR reaction system could be used to identify C. nippon， C. elaphus and their hybridize samples .

[Key words] Cervus nippon； Cervus elaphus； hybridize； multi-PCR reaction system； COI； SRY

鹿茸是我國傳統(tǒng)名藥之一，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有促進生長發(fā)育、強壯身體、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、促進創(chuàng)傷愈合等功能[1-4]。《中國藥典》規(guī)定鹿茸基原為鹿科動物梅花鹿Cervus nippon Temminck 或馬鹿C.elaphus Linnaeus的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，作為名貴中藥材品種，鹿茸在市場上供不應(yīng)求且價格昂貴。

雜交有利于提高畜牧產(chǎn)量，我國的茸鹿種間和亞種間的雜種優(yōu)勢利用一直處于國際領(lǐng)先水平，早在1958年吉林省吉林市龍?zhí)渡铰箞黾从帽窘坏姆椒ㄩ_展家養(yǎng)馬鹿（♀）與梅花鹿（♂）雜交（簡稱馬·花雜交）試驗研究，隨后茸鹿的雜交育種技術(shù)得到推廣與應(yīng)用。其中，馬·花雜交被認為經(jīng)濟性狀最佳雜交組合之一[5-6]。導(dǎo)致中藥市場中除了出現(xiàn)馴鹿、白唇鹿、水鹿等常見動物的茸片等混偽品，還常出現(xiàn)馬·花雜交鹿茸或花·馬雜交鹿茸。而這些鹿茸品質(zhì)特征并不一致，如趙磊等對梅花鹿茸、馬鹿茸、花馬雜交鹿茸等5種鹿茸的常規(guī)成分、無機元素和氨基酸含量進行了測定，結(jié)果表明梅花鹿茸與花馬雜交鹿茸無機元素等營養(yǎng)成分存在差異[7]。另一方面，也缺乏準確可靠的雜交鹿茸鑒別方法，依據(jù)外部形態(tài)、顯微特征、理化性狀的傳統(tǒng)鑒定方法對馬鹿與梅花鹿的雜交鹿茸鑒定存在很大困難。因此，對鹿茸藥材進行正本清源，特別是對雜交鹿茸的鑒別，對保障藥材質(zhì)量具有重要的意義。

分子標記方法具有靈敏性高、準確性好、客觀性較強等優(yōu)勢，目前在鹿茸等貴重藥材及其原動物的分子鑒定方面有不少文獻報道，比如基于COI或Cyt b片段的鹿茸類藥材分子鑒定的相關(guān)文獻報道[8-9]。而以COI基因是線粒體DNA，屬于細胞質(zhì)遺傳，只能作為鑒別其母本的證據(jù)，因此，為了建立對雜交鹿的分子鑒別，還需要Y染色體的上基因作為父本的鑒別標記，其中，Y染色體上的SRY基因作為哺乳動物的性別決定基因，在不同物種間SRY基因的位置、大小、結(jié)構(gòu)等均不相同[10]。因此，SRY基因在分子進化領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[11]。本實驗擬利用COI和SRY基因建立梅花鹿、馬鹿及其雜交鹿的鹿茸樣本的分子鑒別方法。endprint

1 材料

1.1 儀器 微量分光光度計（Nanodrop 2000，Thermo Scientific 公司）； Veriti PCR儀 （Applied Biosystems），5810R 型低溫冷凍離心（ Eppendorf公司），ND-100型核酸蛋白分析儀（Gene 公司），DDZ-11型電池式電動骨鉆（上海醫(yī)療器械集團） 。

1.2 試劑及樣品 TIANDZ柱式骨骼DNAout購自北京天恩澤公司；DL 2 000 plus DNA Marker購自Takara 公司；多重PCR 5×Master Mix購自NEB公司，F(xiàn)astTaq DNA聚合酶購自TransGen公司。三氯甲烷購自北京化工廠，均為國產(chǎn)分析純。鹿茸藥材包括馬鹿、梅花鹿及其混偽品，共計48個樣品，分別購自新疆、吉林、安徽、湖南、重慶、廣西、云南、北京、廣州等地，樣品由金艷鑒定，藥材標本保存于中國中醫(yī)科學院中藥資源中心，見表1。

2 方法

2.1 基因組DNA的提取和純化 取藥材樣品，經(jīng)過75%乙醇表面消毒后，利用骨鉆鉆取20 mg 樣品粉末，飲片則直接粉碎，采用TIANDZ 柱式骨骼DNAout 提取鹿茸總DNA，作為模板用于鹿茸DNA鑒別研究。

2.2 通用引物擴增COI與SRY基因序列 應(yīng)用通用引物CO-F與CO-R擴增COI基因序列，PCR 反應(yīng)程序為：95 ℃，5 min；95 ℃，30 s，45 ℃，1.5 min，72 ℃，1.5 min，5個循環(huán)；95 ℃，1 min，50 ℃，1.5 min，72 ℃，1 min，35個循環(huán)；72 ℃，7 min。獲得PCR產(chǎn)物通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳，并用EB染色觀察，由生工（上海）有限公司測序。

應(yīng)用通用引物SR-F與SR-R擴增SRY基因序列，PCR反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性23 min后，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)后72 ℃延伸7 min。獲得PCR產(chǎn)物通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳，并用EB染色觀察，由生工 （上海） 有限公司測序。

2.3 鑒別標記獲得與引物設(shè)計 根據(jù)測序所獲得的受試樣品的COI，SRY基因序列，并從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載梅花鹿、馬鹿、馴鹿、水鹿等物種的COI，SRY基因序列，利用ClustulX 2.1軟件進行同源對齊，校對后分析其特異性SNP位點，并從特異性SNP 位點中篩選合適的鑒別位點，使用Primer Premier 5.0設(shè)計出梅花鹿、馬鹿的特異性鑒別引物。以梅花鹿COI序列JF700150.1 為參照，選擇COI序列第391位的梅花鹿特異性SNP位點C作為鑒別位點，設(shè)計特異識別梅花鹿的引物CCnF；而以第106位的馬鹿特異性SNP位點C作為鑒別位點，設(shè)計特異識別馬鹿的引物CCeF；并設(shè)計共同的反向引物CCR。梅花鹿SRY序列AB915321.1為參照，選擇SRY序列第69位的梅花鹿特異性SNP位點C作為鑒別位點，設(shè)計特異識別梅花鹿的引物SCnF；而以第446位的馬鹿特異性SNP位點G作為鑒別位點，設(shè)計特異識別馬鹿的引物SCeF；并設(shè)計共同的反向引物SCR。設(shè)計的特異性鑒別引物序列見表2，由生工（上海）有限公司合成。

2.4 雙位點特異 PCR擴增及電泳 分別基于COI與SRY基因序列，利用梅花鹿及馬鹿的特異鑒別引物與通用反向引物分別構(gòu)建1個雙位點特異PCR體系：總體積20 μL，其中包括Taq DNA聚合酶1 U，5×Master Mix 4 μL，2 μmoL·L-1特異鑒別引物各1 μL，2 μmoL·L-1共同反向引物2 μL，滅菌蒸餾水補足20 μL。通過設(shè)置退火溫度梯度（52，54，56，58，60 ℃）考察不同退火溫度對雙位點特異PCR擴增穩(wěn)定性的影響。利用所構(gòu)建的雙位點特異PCR體系，選擇最合適退火溫度對候選樣品進行雙位點特異PCR擴增檢測，循環(huán)數(shù)設(shè)置35個循環(huán)。待PCR擴增反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)體系加6 μL 6×loading buffer，混勻，取混合產(chǎn)物8 μL 點樣于1.5%的瓊脂糖凝膠上，于200 V電壓的條件下電泳8～10 min，經(jīng)EB顯色，最后于凝膠成像儀觀察記錄結(jié)果。

3 結(jié)果分析

3.1 引物設(shè)計 根據(jù)測序結(jié)果及從NCBI 數(shù)據(jù)庫中下載梅花鹿、馬鹿、馴鹿、水鹿等物種的COI，SRY基因序列，分析梅花鹿、馬鹿的特異性SNP位點，并從特異性SNP 位點中篩選合適的鑒別位點，以梅花鹿COI序列JF700150.1 為參照，選擇COI序列第391 位的梅花鹿特異性SNP位點C作為鑒別位點，為提高鑒別能力，把第389位點的堿基由A替換為T，設(shè)計特異識別梅花鹿的引物CCnF；而以第106位的馬鹿特異性SNP 位點C作為鑒別位點，并把第104位點的堿基由G替換為C，設(shè)計特異識別馬鹿的引物CCeF；并設(shè)計共同的反向引物CCR，則可通過PCR擴增獲得232 bp的梅花鹿特異片段，而產(chǎn)生518 bp的馬鹿特異片段。以梅花鹿SRY序列AB915321.1為參照，選擇SRY序列第69位的梅花鹿特異性SNP位點C作為鑒別位點，而把第67位點的堿基由T替換為A，設(shè)計特異識別梅花鹿的引物SCnF；而以第446位的馬鹿特異性SNP位點G作為鑒別位點，而把第444位點的堿基由T替換為A，設(shè)計特異識別馬鹿的引物SCeF；并設(shè)計共同的反向引物SCR。則可通過PCR擴增獲得803 bp的梅花鹿特異片段，而產(chǎn)生425 bp的馬鹿特異片段，見圖1和表2。

3.2 建立雙位點特異PCR鑒別受試梅花鹿、馬鹿與其雜交鹿樣品 基于基因序列，利用梅花鹿特異鑒別引物CCnF及馬鹿特異鑒別引物CCeF與通用反向引物CCR構(gòu)建1個雙位點特異PCR體系，另 外，基于SRY基因序列，利用梅花鹿特異鑒別引物SCnF及馬鹿特異鑒別引物SCeF與通用反向引物SCR構(gòu)建另一個雙位點特異PCR體系，通過退火溫度梯度實驗，分析退火溫度對PCR反應(yīng)效率的影響，結(jié)果顯示，這2個反應(yīng)體系在退火溫度52～60 ℃條件下均能擴增出梅花鹿與馬鹿相應(yīng)的特異鑒別條帶。endprint

選擇退火溫度56 ℃，使用以上建立的反應(yīng)體系，分別對不同來源的梅花鹿、馬鹿與其雜交鹿的鹿角樣品進行鑒別，受試8個梅花鹿鹿角樣品，7個馬鹿鹿角樣品及5個馬·花雜交的鹿角樣品分別檢測到相應(yīng)的陽性特異性條帶，而馴鹿與水鹿等陰性樣品則擴增不到條帶。表明該體系具有特異性，可以直接鑒別梅花鹿、馬鹿與其雜交鹿的鹿茸樣，見圖2。

3.3 對市場流通的待測鹿茸樣品進行鑒別分析 利用以上建立的雙位點特異PCR體系，對重流通市場中收集的8批待測的梅花鹿鹿茸樣品、16批待測的馬鹿鹿茸樣品進行鑒別，結(jié)果顯示受試8個待測的梅花鹿鹿茸樣品的COI，SRY基因序列均屬于梅花鹿，表明其父母本均為梅花鹿。而16個待測的馬鹿鹿茸樣品的COI基因序列均屬于馬鹿，而其中有3個樣品的SRY基因序列并不屬于馬鹿，而屬于梅花鹿，表明其父本為梅花鹿，即為馬·花雜交的鹿茸樣品（見星號標注），見圖3。

4 討論

雜交育種是選育新品種主要途徑，是育種工作最重要的方法，農(nóng)林雜交育種主要以經(jīng)濟效益為導(dǎo)向，育種目標包括提高抗逆，產(chǎn)量，品質(zhì)等。對于藥用動植物，育種目標既要提高入藥部位的生物產(chǎn)量，更要提高藥用成分的相對含量。其中，對于鹿茸的生產(chǎn)，我國早在1958年就把雜交育種技術(shù)應(yīng)用于鹿茸的生產(chǎn)，并經(jīng)1987—1992年大規(guī)模推廣應(yīng)用，大幅度提高養(yǎng)鹿業(yè)生產(chǎn)力和經(jīng)濟效益[5-6，12] 。而對于中藥，雜交育種還要考慮對中藥藥性的影響。因此，如何鑒別雜交基原的中藥材是中藥分子鑒定領(lǐng)域重要關(guān)注點。目前，對雜交鹿茸藥性藥效是否與親本一致仍無完善評價方法，且缺乏準確區(qū)分雜交與非雜交品的方法。本研究對市場流通的鹿茸樣品隨機選樣進行鑒別分析，在24個馬鹿鹿茸的待測樣品就發(fā)現(xiàn)有3個是馬·花雜交鹿茸，可見市場流通的雜交鹿茸比例較高。據(jù)報道[5]，馬·花雜交F1生長速度顯著高于花·馬雜交F1，呈母本顯性遺傳，成年時體重和體型與母本鹿（馬鹿）的相近，且茸生長快，其生長天數(shù)短，而茸質(zhì)嫩，再生茸大、嫩又成型。而其茸型和肉質(zhì)又多能呈父本顯性遺傳，不僅是最佳的茸肉兼用型鹿，還是茸血兼用鹿，具有較高的經(jīng)濟效益，這可能是市場流通中的具有較高比例的馬·花雜交鹿茸的原因。而馬·花雜交鹿茸的藥用價值還有待進一步研究分析。

目前以線粒體序列建立的鹿茸分子鑒別方法，只能作為鑒別其母本的證據(jù)，對雜交鹿無法進行直接鑒別，為了建立雜交鹿茸的分子鑒別方法，本研究利用Y染色體的SRY基因作為父本的鑒別標記。目前，SRY基因在分子進化領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，如蔡欣等利用SRY基因多態(tài)性對牦牛與其他家牛屬動物及其父系進化關(guān)系分析[11]；周盼伊等利用SRY基因進行家養(yǎng)梅花鹿品種Y染色體遺傳多樣性和父系遺傳結(jié)構(gòu)分析[13]；蘇瑩等利用Y染色體SRY基因?qū)︸R鹿的遺傳多樣性進行研究[14]，以上研究均表明SRY基因多態(tài)性可進行哺乳動物父本的溯源分析。因此，本研究選擇SRY作為雜交鹿的父本鑒定標記，結(jié)合母本標記基因COI，可有效進行雜交鹿的父母本鑒定。

本研究分別基于COI與SRY基因序列建立了2個雙位點特異PCR體系，用于鑒別鹿茸樣品的父母本來源，初步建立了雜交鹿茸的鑒定方法。本研究過程中，試圖把2個雙位點特異PCR體系優(yōu)化成1個多重PCR體系，發(fā)現(xiàn)在同一PCR系統(tǒng)中，基于SRY基因的鑒別引物擴增效率很低，且不穩(wěn)定，推測是同一樣品中基因組DNA拷貝數(shù)遠遠低于線粒體DNA的拷貝數(shù)，導(dǎo)致PCR擴增時擴增效率顯著低于基于COI的鑒別引物。后續(xù)可通過降落PCR方法等進一步優(yōu)化，構(gòu)建有效穩(wěn)定單一的多重PCR鑒別方法，可更簡便進行雜交鹿茸的分子鑒定。本研究結(jié)果對雜交鹿茸鑒別也具有實際應(yīng)用價值，也為后續(xù)進行雜交鹿茸的品質(zhì)評價時提供有效的鑒別方法。

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[責任編輯 呂冬梅]endprint