杜翊+章燕珍+譚小釘

摘 要 目的：運用實驗設計（DOE）方法優(yōu)化抗體偶聯藥物（ADC）處方篩選，以得到適用于該ADC藥物的較優(yōu)處方。方法：利用JMP 10軟件進行DOE，考察蛋白濃度、pH、蔗糖和吐溫20濃度等因素對ADC藥物穩(wěn)定性的影響。結果：經過DOE方法的優(yōu)化，得到了蛋白濃度（10 mg/ml）、pH （5.0）、蔗糖濃度[6%（w/v）]和吐溫20濃度[0.02%（w/v）]的優(yōu)選組合。結論：DOE方法能優(yōu)化處方，提高ADC藥物的穩(wěn)定性，為其他ADC藥物的處方篩選提供了借鑒。

關鍵詞 實驗設計 ADC藥物 處方篩選

中圖分類號：R927.11； R979.19 文獻標識碼：A 文章編號：1006-1533（2018）01-0071-05

Application of design of experiment in the formulation screening of antibody drug conjugate

DU Yi， ZHANG Yanzhen， TAN Xiaoding*

（Central Research Institute， Shanghai Pharmaceuticals Holding Co.， Ltd.， Shanghai 200237， China）

ABSTRACT Objective： To optimize the formulation screening of antibody drug conjugate （ADC） by a method of design of experiment （DOE） so as to obtain a superior formulation for the ADC drug. Methods： DOE was performed by a software JMP 10 to investigate the effects of the concentrations of protein， sucrose and polysorbate 20 and pH value on the stability of ADC drug. Results： A preferred combination including 10 mg/ml protein， 6% （w/v） sucrose and 0.02% （w/v） polysorbate 20 and pH 5.0 was obtained by optimization of DOE method. Conclusion： DOE can optimize the formulation and improve the stability of ADC drug. This study can also provide a reference for the screening of other ADC drugs.

KEY WORDS design of experiment； ADC drugs； formulation screening

在過去的幾十年中，抗腫瘤藥物研發(fā)取得巨大進展，尤其是生物制品的出現，使臨床可選的抗腫瘤藥物品種顯著增加。傳統(tǒng)小分子化療藥物具有非特異性，容易引起嚴重的不良反應；具有靶向性的單克隆抗體選擇性較強，不良反應較輕，但是由于單克隆抗體靶向治療的有效率并不高，且存在耐藥與療效問題，因此，抗體-藥物偶聯物（antibody-drug conjugate，ADC）作為一種新型藥物結合了抗體的靶向性和小分子藥物的細胞毒作用[1-2]。ADC藥物進入體內后，通過單抗的導向作用與靶細胞表面的抗原結合，進入靶細胞內，然后通過化學或酶促作用釋放小分子藥物而殺滅靶細胞[3]。

ADC藥物制劑處方開發(fā)的目標是確保為患者提供質量穩(wěn)定可靠的產品。與傳統(tǒng)單抗藥物相比，在安全、質量和療效等方面，ADC藥物具有其獨特的物理化學性質。其質量屬性通常可以分為三類：與抗體本身相關、與小分子藥物相關及與抗體-小分子偶聯形式相關。如抗體本身相關的聚體，可影響藥物的免疫原性[4]及藥代動力學特性；游離小分子會影響藥物的安全性；抗體藥物偶聯比可影響藥物安全性和藥代動力學特性[5]。這些關鍵屬性都可能因處方的不同而改變，因此，篩選出好的處方對于ADC藥物保持良好的穩(wěn)定性和安全性具有重要意義。

實驗設計（DOE）是以數理統(tǒng)計和概率論為基礎、合理安排實驗的方法論，研究如何制定實驗方案，以提高效率，縮小誤差，高效且經濟地獲取數據，并進行分析處理，最后得出正確的結論。傳統(tǒng)的多數設計是先追求目標值，通過篩選不同因素來減少波動，結果只能得到單因素的最優(yōu)化，但是由于參數搭配不佳而整體性能不穩(wěn)定。田口方法則是先追求產品的穩(wěn)定性，通過分析質量特性與不同元素之間的非線性關系（交互作用），找出穩(wěn)定性的最佳水平組合[6-7]。隨著DOE的廣泛使用，越來越多的DOE軟件得到開發(fā)和應用，如SPSS、Minitab、JMP等。其中，JMP是賽仕軟件公司（Statistical Analysis System）推出的一種交互式可視化統(tǒng)計分析軟件，其實驗設計內容豐富，實驗設置靈活，分析功能強大，可大大提高實驗效率[8-10]。因此，本研究應用JMP 10.0軟件進行田口實驗設計，對得到的數據進行分析，預測實驗結果并找出最佳參數。

1 材料與方法

1.1 ADC藥物

本研究中的ADC藥物為注射用重組抗HER2人源化單克隆抗體-MCC-DM1偶聯劑，是一種由氨基酸序列和曲妥珠單抗（赫賽汀，herceptin）相同的抗體與細胞毒類藥物美登素衍生物（DM1）通過不可裂解的硫醚連接橋偶聯而成的制劑，連接分子（linker）為SMCC。由上海醫(yī)藥集團股份有限公司中央研究院生物藥物室制備。endprint

1.2 主要儀器和試劑

BSA822電子天平（賽多利斯公司）；Akta avant蛋白純化系統(tǒng)（GE）；1260高效液相色譜儀（安捷倫公司）；SpectraMax M5多功能酶標儀及SoftMax分析軟件（美國Molecular Devices）；PA 800 plus毛細管電泳儀（貝克曼公司）；紫外分光光度計（Thermo Fisher Scientific）。琥珀酸、吐溫20（J. T. Baker）；蔗糖、氫氧化鈉（湖南爾康制藥股份有限公司）；超純水（自制）。

1.3 處方DOE設計

根據單因素實驗結果選取蛋白濃度、pH、蔗糖濃度及吐溫20濃度用于DOE試驗。利用JMP 10.0進行DOE設計，其中蛋白濃度選取3水平、pH為2水平、蔗糖濃度為3水平、吐溫20濃度為3水平，共設計18個試驗組（表1）。

1.4 緩沖液置換及穩(wěn)定性考察

稱取適量的蔗糖、琥珀酸和吐溫20溶解于超純水中，用3 mol/L氫氧化鈉調節(jié)溶液pH，配制成表1中的不同蔗糖濃度、不同pH和不同吐溫20濃度的處方緩沖溶液。

使用Akta avant蛋白純化系統(tǒng)連接分子篩將適量的ADC藥物樣品置換至上述配制好的處方溶液中。置換好后的溶液無菌過濾并分裝至6 ml的滅菌西林瓶中，壓塞，

加鋁塑蓋，在25 ℃條件下進行加速穩(wěn)定性實驗，考察時間為3個月。

2 質量指標

方法均為企業(yè)自行開發(fā)并驗證。

2.1 尺寸排阻色譜法（SEC）純度分析

色譜柱：TSKgel G3000SWXL（7.8 mm×300 mm，5 mm）；流動相：（20 mmol/L 磷酸二氫鉀+0.25 mol/L氯化鉀，pH=6.95±0.05）-異丙醇=85∶15；流速：0.5 ml/min；上樣量：100 mg；柱溫：室溫；樣品池溫度：8 ℃；檢測波長：280 nm。用Agilent 1260高效液相分析系統(tǒng)對實驗結果進行數據處理，用面積歸一化法計算純度。

2.2 CE-SDS純度分析

將樣品用純水稀釋至5.0 mg/ml，將20 ml 樣品、75 ml SDS-MW樣品緩沖液、2 ml內標和 5 ml 0.25 mol/L碘乙酰胺（非還原CE-SDS）混勻后，65 ℃孵育4 min，冷卻至室溫，取100 ml，采用Beckman PA800 plus毛細管電泳系統(tǒng)上樣分析， 于15 kV分離，毛細管溫度及樣品傳送帶溫度均為20 ℃，檢測波長為220 nm。

2.3 游離小分子分析

色譜柱：Agilent ZORBAX 300SB-C18（4.6 mm×100 mm，3.5 mm）；流動相：0.02% TFA水溶液（流動相A），0.02% TFA乙腈溶液（流動相B）；流速：1.0 ml/min；上樣量：20 ml；柱溫：30 ℃；檢測波長：252 nm。用Agilent 1260高效液相分析系統(tǒng)對實驗結果進行數據處理，用面積歸一化法計算游離小分子的量。

2.4 體外生物學活性分析

0.25% Trypsin-EDTA消化BT-474細胞，用 DMEM/ F12完全培養(yǎng)基將細胞重懸，調整活細胞密度至1.5×105 cells/ml，100 ml/孔加入96孔板，37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～4 h。用DMEM/F12完全培養(yǎng)基將抗體稀釋至5 mg/ml，再用稀釋液2倍系列稀釋（共9個梯度），50 μl/孔加入96孔細胞培養(yǎng)板，以DMEM/F12完全培養(yǎng)基作為陰性對照，以參比品作為陽性對照。37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，加入CCK-8染色液，每孔25 ml。5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～6 h。以450 nm讀取酶標儀上吸光度值。結果計算：利用SoftMax軟件分析數據，以抗體濃度對數為橫坐標，對應吸光度值為縱坐標，選用四參數方程回歸模型，擬合抗體劑量效應曲線。按下式計算生物學活性：

3 結果

3.1 處方篩選SEC、CE-SDS、游離小分子及體外生物學活性結果

本研究中采用SEC聚體、CE-SDS小分子片段、游離小分子含量及體外生物學活性進行后續(xù)的分析，結果如圖1所示。

25 ℃加速條件放置下，SEC聚體、CE-SDS小分子片段和游離小分子3個月與0個月的差值越小表示處方前后變化越小，越穩(wěn)定。圖1初步顯示：可以看出高濃度蛋白的處方SEC聚體變化明顯高于低濃度蛋白的處方。低、中濃度蛋白組的體外生物學活性整體高于高濃度蛋白組。

3.2 處方DOE數據分析

選擇SEC聚體、CE-SDS小分子片段、游離小分子25 ℃加速3個月與0個月時的變化值和3個月時各處方的體外生物學活性為響應值，應用JMP 10.0軟件對田口正交表L18（21×33）中的處方進行預測刻畫，刻畫結果如圖2所示，各處方的刻畫意愿如表2所示。

圖2顯示pH較低時，處方的意愿增高；蛋白濃度10 mg/ml和20 mg/ml對于整體意愿的影響比30 mg/ml??；10 mg/ml時的最佳處方意愿值0.76，20 mg/ml時的最佳處方意愿值為0.71，30 mg/ml時最佳處方意愿值僅0.51。因此為了保證ADC藥物的穩(wěn)定，處方蛋白濃度應該低于30 mg/ml。表2顯示處方B和處方H的意愿值分別為0.76和0.71，二者的意愿值相差不大，為了后續(xù)工藝的可行性及臨床使用的方便性和安全性，最終選擇蛋白濃度為20 mg/ml，即最后選擇的 ADC藥物的較優(yōu)處方為處方H，即pH 5.0、蛋白濃度 20 mg/ml、蔗糖含量6%（w/v）及吐溫20含量0.02%（w/v），并對該處方的一批成品進行長期穩(wěn)定性考察。endprint

3.3 長期穩(wěn)定性考察結果

對上述處方下的一批成品進行長期穩(wěn)定性考察。長期穩(wěn)定性試驗溫度定為2～8 ℃，考察12個月。分別在試驗期第0、3、6、9、12個月末取樣分析SEC純度、游離小分子藥物、DAR和生物活性等相關指標，結果如圖3所示。

圖3表明成品在2～8 ℃條件下放置12個月期間，SEC純度、CE-SDS純度、生物學活性、游離小分子和DAR均無明顯變化。說明在優(yōu)化處方（處方H）下，樣品在2～8 ℃條件放置12個月后質量穩(wěn)定性良好。

4 討論

本研究通過對蛋白濃度、pH、蔗糖濃度和吐溫20濃度的優(yōu)化，篩選出優(yōu)化處方H，即20 mg/ml ADC藥物、6%（w/v）蔗糖、0.02%（w/v）吐溫20和pH 5.0。在該處方下，樣品在25℃加速3個月后，聚體、小分子片段及游離小分子的變化較小，體外生物學活性較高，經JMP 10.0預測刻畫后，意愿值較高。經長期穩(wěn)定性考察，ADC藥物的各項理化性質保持良好的穩(wěn)定性，表明該處方適合此ADC藥物。

抗體偶聯藥物的處方研發(fā)與傳統(tǒng)藥物類似，盡管如此，當將小分子與偶聯藥物的質量屬性一起考慮時，制劑處方開發(fā)將變得更加復雜，需要考慮的因素更多。聚體是由天然或變性單體組成的高分子量蛋白質，是導致免疫原性的重要因素之一[11-13]；聚體和小分子片段為樣品中的大小變異體，影響樣品整體的純度；樣品中游離小分子的含量則影響安全性，若樣品中存在較高的游離小分子藥物，將對正常細胞造成嚴重損傷[14-15]。生物學活性測定是生物測定的重要內容，因此，本研究采用SEC聚體、CE-SDS小分子片段、游離小分子和體外生物學活性作為刻畫的關鍵質量屬性，得到了使ADC藥物穩(wěn)定的優(yōu)化處方。表明這四個關鍵質量屬性適合用于ADC藥物處方篩選的DOE刻畫。此DOE方法達到了預期的優(yōu)化效果，且具有較好的穩(wěn)定性。本研究將田口正交法用于ADC藥物處方篩選設計中，通過較少的實驗次數，獲取優(yōu)化后的設計參數，提高設計效率，降低了設計成本，為其他ADC藥物的處方篩選提供了借鑒。

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