李 偉,李夢雪,張方榮,王 亮,黃建新

(西北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 陜西 西安 710069)

生物表面活性劑,指微生物在一定條件下,在其代謝過程中產(chǎn)生的包括親水基和疏水基結(jié)構(gòu)的兩性化合物,是一種天然的表面活性劑[1-2]。作為提高原油采收率和原油污染土壤生物修復(fù)的主要機制之一,生物表面活性劑因具有成本低、活性強、不造成二次污染等優(yōu)點而得到廣泛應(yīng)用[3-4]。

目前,對于普通油藏與土壤環(huán)境而言,微生物采油與土壤修復(fù)菌劑已有規(guī)模化產(chǎn)品,并在實際應(yīng)用方面也已取得理想效果[5-8]。但是，隨著世界范圍內(nèi)很多油田都表現(xiàn)出地層水礦化度過高、石油污染土壤鹽堿化嚴(yán)重的問題,使得耐高礦化采油與土壤修復(fù)的微生物研究越來越受到重視。 Makkar等人報道的芽孢桿菌、Kumar等人報道的假單胞菌以及Gesheva等人報道的紅球菌,菌種本身以及其所產(chǎn)生物表面活性劑均有一定耐鹽性[9-11],黃楊等報道的磷脂類生物表面活性劑可以在20 g/L的鹽濃度下仍保持其生物活性[12]。目前,高礦化的水體和土壤對表面活性劑影響的研究,主要是通過利用不同濃度NaCl對表面活性劑活性影響的不同來進(jìn)行研究。實際應(yīng)用中,驅(qū)油微生物或生物表面活性劑所直接接觸的是油藏地層以及表層土壤的高礦化環(huán)境,因而該方法必然忽略了高礦化條件中其他無機鹽離子對驅(qū)油微生物或生物表面活性劑的影響。

位于渤海灣沿岸的勝利油田和冀東油田、位于典型的內(nèi)陸鹽堿濕地的松嫩平原上的大慶油田和吉林油田、以及我國西北內(nèi)陸的各大油田,很多都表現(xiàn)出油井地層水礦化度高、周圍土壤鹽堿化嚴(yán)重的問題[13],其中部分油藏的地層水礦化度可達(dá)10%～17%,甚至更高。本研究從我國西北某高礦化油田的油水混合物中分離篩選得到一株高效生物表面活性劑產(chǎn)生菌K1,在高礦化條件下,對其所產(chǎn)表面活性劑乳化性及其溫度、酸堿度(pH)對表面活性劑的影響進(jìn)行研究,為高礦化條件下利用生物表面活性劑提高石油采收率以及進(jìn)行石油污染土壤修復(fù)提供了有效菌源與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實驗樣品 用于耐高礦化表面活性劑產(chǎn)生菌篩選的油水混合物與原油取自我國西北某油田;高礦化水為該油田采油回流注入水,總礦化度為107.7 g/L,pH6.4。

1.1.2 培養(yǎng)基 ① 耐高礦化產(chǎn)表面活性菌株富集培養(yǎng)基:(NH4)2SO40.5 g;NaNO30.5 g;KH2PO41.0 g;高礦化水1 000 mL;原油 10 mL;pH7.0。② 種子培養(yǎng)基:牛肉膏 3 g;蛋白胨10 g; NaCl 5 g;酵母膏 0.5 g;蒸餾水1 000 mL;pH7.0。③ 發(fā)酵產(chǎn)表面活性劑培養(yǎng)基:NaCl 3 g;KH2PO45 g;MgSO4·7H2O 0.5 g;酵母膏1 g;葡萄糖20 g;蒸餾水1 000 mL;pH7.0。

1.2 方 法

1.2.1 菌株分離篩選 ① 取5 mL高礦化油水混合物于已滅菌的富集培養(yǎng)基中,搖床(30℃,150 r/min)培養(yǎng)7 d。同樣條件轉(zhuǎn)接富集培養(yǎng)3次后,將培養(yǎng)物于高礦化富集培養(yǎng)基平板上連續(xù)涂布,分離純化后得到6株細(xì)菌。② 將6株細(xì)菌分別接入種子培養(yǎng)基,搖床(30℃,150 r/min)培養(yǎng)2 d后,以5%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基,同樣條件下培養(yǎng)3 d。分別測定6株細(xì)菌發(fā)酵液排油圈大小[14],篩選出發(fā)酵液排油圈直徑最大的菌株K1。

1.2.2 菌株鑒定 參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》(8版)[15],對菌株K1進(jìn)行生理生化反應(yīng)鑒定;將已分離的菌種K1進(jìn)行稀釋涂平板,30℃恒溫培養(yǎng)48h后挑取單菌落于50 μL的無菌超純水中，在PCR儀上95℃裂解15 min，取1 μL裂解液作為擴增的模板,以引物27F和 1495R進(jìn)行16S rRNA基因擴增,純化后送至上海生工進(jìn)行測序。將測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中利用BLAST進(jìn)行序列比對,選取同源性較高的菌株用MEGA6.06中的Neighbor-joining計算方法, Bootstrap選擇500次重復(fù),模型選擇核酸p-distance,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[15]。

1.3 菌株所產(chǎn)表面活性劑的鑒定及乳化性、穩(wěn)定性研究

1.3.1 表面活性劑提取 發(fā)酵液離心(8 000 r/min,10℃,20 min)去除菌體;上清液用HCl 調(diào)至pH2.0,4℃靜置過夜。10 000 r/min離心20 min,將沉淀用酸化水(pH2.0)洗滌兩次,離心收集沉淀得到粗產(chǎn)品。將粗產(chǎn)品用CH2Cl2萃取,減壓濃縮至干,溶于0.01 mol/L的NaOH,濾紙過濾;濾液用6 mol/L的HCl將pH調(diào)至2.0,再次出現(xiàn)沉淀時,于10 000 r/min,10℃的條件下離心30 min,沉淀冷凍干燥,即得到純化的表面活性劑[16]。

1.3.2 表面活性劑定性分析 ① 冷凍干燥的表面活性劑進(jìn)行薄層層析定性分析:以氯仿/甲醇/水(體積比為65∶15∶20)為展開劑,用不同的顯色劑顯色初步確定表面活性劑的類型:苯酚-硫酸試劑:糖脂顯棕色;鉬酸銨-高氯酸試劑:磷脂及類脂顯藍(lán)綠色;茚三酮顯色劑:肽脂顯紅色[17]。② 采用 FTIR-650 傅立葉變換紅外光譜儀對冷凍干燥后的樣品進(jìn)行紅外光譜掃描。。

1.3.3 表面活性劑的乳化性 向2只加有5 mL柴油的試管中,分別加入由高礦化水和蒸餾水配制成的濃度為0.2 g/L的表面活性劑溶液5 mL,渦旋儀高速渦旋2 min,30℃靜置,每12 h計算1次乳化率[18]。

乳化指數(shù)=乳化層高度/體系總高度

1.3.4 溫度與酸堿度(pH)對表面活性劑的影響分別用高礦化水和蒸餾水中配制成濃度為0.2 g/L的表面活性劑溶液,在不同溫度(30℃，40℃，50℃，60℃，70℃，80℃，90℃)下保持30 min,冷卻至室溫測定溶液表面張力;將兩種表面活性劑溶液調(diào)節(jié)成不同pH值(1，3，5，6，7，9，11),靜置30 min后,測定溶液表面張力。

2 結(jié)果與討論

2.1 耐高礦化產(chǎn)表面活性劑菌株的篩選及鑒定

圖1 菌株K1發(fā)酵排油圈Fig.1 Oil-excluding-ring test of K1

從油水樣中分離純化得到耐高礦化株菌K1,經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后菌株K1發(fā)酵液排油圈明顯(圖1)說明其具有較好的產(chǎn)表面活性劑能力。同時,K1在高礦化富集培養(yǎng)基與高礦化富集平板中生長較好,說明其對107.7 g/L的高礦化條件具有良好的耐受性。

菌株K1在牛肉膏蛋白胨平板上生長良好,30℃培養(yǎng) 24 h后, 菌落呈乳白色,半球形突起,表面光滑。菌體革蘭氏染色為陰性,短桿狀,無芽孢,如圖2。其主要生理生化特性見表1。

圖2 菌株K1顯微鏡照片(9×100)Fig.2 Microscope photo of K1

Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of strain K1

生理生化特征生理生化特征過氧化氫酶實驗+明膠實驗-葡萄糖發(fā)酵實驗+吲哚實驗-乙酰甲基甲醇實驗-苯丙氨酸脫氫酶實驗-酪氨酸水解實驗-硝酸鹽還原實驗+甲基紅實驗-檸檬酸鹽實驗+淀粉水解實驗-革蘭氏染色-運動性-

注:表中“+” 表示反應(yīng)陽性,“-” 表示反應(yīng)陰性。

經(jīng)測定,菌株K1的16S rRNA序列共1447 bp。測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對,同源性比對結(jié)果顯示,與該序列一致性大于99%的菌株為克雷伯氏菌屬(Klebsiellasp.),其 GenBank序列號為KY963669。以菌株K1的16S rRNA基因為基礎(chǔ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖 3),可以看出,菌株K1與肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)親緣關(guān)系最近。根據(jù)形態(tài)觀察、生理生化特征和16S rRNA 基因分析,初步鑒定 K1為肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)。

圖3 基于菌株K1的16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain K1 based on 16S rRNA

2.2 菌株K1所產(chǎn)生物表面活性劑的定性分析及乳化性、穩(wěn)定性

2.2.1 表面活性劑的提取 菌株K1所產(chǎn)生物表面活性劑呈黃色黏稠狀,冷凍干燥后為黃色粉末,產(chǎn)量為 0.5～0.6 g/L。

2.2.2 表面活性劑定性分析 表面活性劑進(jìn)行薄層層析,樣品斑點苯酚-硫酸試劑的顯色反應(yīng)為黃棕色,如圖4,其他顯色試劑均無反應(yīng)。

圖4 產(chǎn)生物表面活性劑薄層色譜分析Fig.4 Thin layer chromatography analysis

紅外光譜分析如圖5所示:1 060～800 cm-1對應(yīng)環(huán)烷烴的環(huán)骨架,且1 560.6 cm-1處的吸收峰是環(huán)烷烴結(jié)構(gòu)吸收峰,表明分子中有環(huán)狀結(jié)構(gòu);3 424.61 cm-1波段吸收峰強且寬,可判斷分子中含有大量—OH基;1 682.65 cm-1處為CO的伸縮振動峰;在3 100～2 900 cm-1波段范圍內(nèi)為糖類 C—H 的伸縮振動峰,并且在1 310～1 000 cm-1范圍內(nèi)存在C—O—C的羧酸酯基團(tuán)[19]。結(jié)合薄層色譜分析結(jié)果,初步判斷K1所產(chǎn)生物表面活性劑為含有多元環(huán)烴的糖脂類物質(zhì)。

圖5 菌株K1所產(chǎn)生物表面活性劑的紅外吸收光譜圖Fig.5 Infra-red spectrogram of biosurfactantfrom K1

2.2.3 表面活性劑乳化活性 菌株K1所產(chǎn)生物表面活性劑乳化性在100 h內(nèi)的變化情況如圖6。48 h后乳化層高度不再變化,乳化率基本恒定,此時表面活性劑高礦化水溶液乳化率為59.5%,與蒸餾水溶液(65.2%)相比稍有下降。這是由于高礦化水的酸性條件使表面活性劑的活性受到一定影響,而高礦化水中的無機鹽同時會引發(fā)乳狀液轉(zhuǎn)相[20],從而使乳化相減少。結(jié)果表明,在礦化度為107.7 g/L的條件下,菌株K1所產(chǎn)生物表面活性劑仍然表現(xiàn)出良好的乳化活性,說明該生物表面活性劑具有一定的耐高礦化性。

圖6 菌株K1所產(chǎn)生物表面活性劑的乳化性Fig.6 Emulsifyng ability of biosurfaetan from K1

2.2.4 溫度與酸堿度(pH)對表面活性劑穩(wěn)定性的影響 常用的評價表面活性劑性能的方法包括測定表面張力、排油活性、油水界面張力等。本研究通過測定表面活性劑溶液的表面張力來對K1菌所產(chǎn)生物表面活性劑的活性進(jìn)行評價。表面活性劑溶液在不同溫度處理后的表面張力變化如圖7所示。

圖7 溫度對菌株K1所產(chǎn)生物表面活性劑的影響Fig.7 Heat stability of biosurfctan from strain K1

由圖7可知,不同溫度處理后含表面活性劑的蒸餾水與含表面活性劑的高礦化水溶液表面張力均有所變化。30℃～50℃時2種表面活性劑溶液的表面張力均比較穩(wěn)定;當(dāng)溫度繼續(xù)升高時兩種溶液的表面張力值同時增大,但增大趨勢并不明顯,到90℃時表面張力仍然保持在較低值。結(jié)果表明:菌株K1所產(chǎn)生物表面活性劑在高礦化度條件下具備良好的降低液體表面張力的活性,并且具有良好的溫度適應(yīng)性,可耐受90℃的溫度。由此可見，含表面活性劑的高礦化水溶液的表面張力高于含表面活性劑蒸餾水溶液。其原因是由于一定范圍內(nèi)液相中所加入表面活性劑的量與加入后溶液的表面張力下降率呈正相關(guān),而高礦化水本身表面張力比蒸餾水高,當(dāng)加入等量的表面活性劑后,在表面張力下降率相同的情況下高礦化水溶液表面張力仍然比蒸餾水高,此現(xiàn)象在酸堿度(pH)對表面活性劑穩(wěn)定性的影響測定中同樣出現(xiàn)。此外由于該高礦化水的偏酸性條件以及部分無機鹽離子的影響,使表面活性劑的的活性有所降低。

酸堿度對表面活性劑影響如圖8所示,pH由1增大到6時,兩種表面活性劑溶液的表面張力均迅速下降到50 mN/m以下,說明在該范圍內(nèi)隨著pH值的增大表面活性劑活性不斷增強,這與藍(lán)慧、陳帥等[21]的研究結(jié)論一致。在pH值增大過程中表面活性劑高礦化水溶液表面張力出現(xiàn)了大幅下降,當(dāng)pH接近7時其表面張力基本與蒸餾水溶液相同。這可能是由于堿性條件下高礦化水中部分無機鹽離子發(fā)生沉淀,一方面使水體本身表面張力有所降低,另一方面表面活性劑所受到的部分離子的抑制作用有所減小而表現(xiàn)出較高的活性。在 pH7.0～11. 0 范圍內(nèi),兩種溶液表面張力均比較穩(wěn)定,基本維持在40～50 mN/m之間。結(jié)果表明，高礦化條件下菌株K1所產(chǎn)生物表面活性劑在pH 7.0～11. 0 范圍具有良好的穩(wěn)定性,過酸會對該生物表面活性劑造成明顯的破壞。

圖8 酸堿度(pH)對菌株K1所產(chǎn)對生物表面活性劑的影響Fig.8 Effect of pH on biosurfactant from strain K1

3 結(jié) 語

從高礦化油水混合物中篩選到一株表面活性劑高產(chǎn)菌株K1,避免了只有一種無機鹽而忽略油藏地層以及表層土壤的高礦化復(fù)雜環(huán)境對菌株的影響,同時著重研究了耐高礦化菌株K1產(chǎn)生的表面活性劑的性質(zhì)。

1)從高礦化油水混合物中分離到一株耐高礦的生物表面活性劑產(chǎn)生菌K1,經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化特征及其16S rRNA基因分析,鑒定該菌株為肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)。

2)薄層色譜與紅外光譜分析初步確定K1細(xì)菌所產(chǎn)生物表面活性劑為糖脂類物質(zhì)。

3)高礦化條件下菌株K1所產(chǎn)生物表面活性劑在礦化度為107.7 g/L，pH 7.0～11.0、溫度30～90 ℃范圍的條件下具有較好的乳化活性,在作用48 h后,對柴油的乳化率穩(wěn)定維持在59.5%。

4)本研究獲得的耐高礦化的生物表面活性劑產(chǎn)生菌K1對高礦化油藏微生物采油或原油污染土壤的生物修復(fù)具有很好的應(yīng)用潛力。

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