楊立坤 傅力 牛燕媚

1天津醫(yī)科大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)系（天津300070）2天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（天津300070）

有氧運(yùn)動可促進(jìn)機(jī)體能量代謝平衡，預(yù)防肥胖癥、2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）等多種代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展，但其中機(jī)制尚不完全清楚。運(yùn)動后，骨骼肌細(xì)胞會發(fā)生適應(yīng)性改變，如增加糖原儲存、促進(jìn)新的蛋白質(zhì)合成。研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌收縮可增加細(xì)胞蛋白質(zhì)（如受損蛋白、錯誤編碼蛋白、錯誤折疊蛋白等）降解、調(diào)節(jié)肌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子活性，此過程也伴隨著泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system，UPS）的激活[1-3]。UPS是調(diào)控細(xì)胞蛋白質(zhì)降解的重要途徑之一。細(xì)胞內(nèi)的UPS將蛋白質(zhì)降解為小分子多肽，蛋白水解酶可進(jìn)一步將多肽分解為氨基酸，促進(jìn)氨基酸池的更新，從而增加蛋白質(zhì)的從頭合成（De novosynthesis）[4]。目前，UPS與骨骼肌代謝之間的聯(lián)系尚不明確。因此，深入探究運(yùn)動與UPS之間的關(guān)系可有助于揭示運(yùn)動改善代謝性疾病的潛在機(jī)制。

1 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)概述

UPS廣泛存在于真核細(xì)胞，是一種依賴三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的非溶酶體型蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)。UPS由泛素活化酶（ubiquitin-activating enzyme，E1）、泛素結(jié)合酶（ubiquitin-conjugating enzyme，E2）、泛素連接酶（ubiquitin-protein ligating enzyme，E3）及26S蛋白酶體組成。在催化過程中，三種酶共同作用將小分子泛素（ubiquitin，Ub）標(biāo)記到底物蛋白，此過程即為泛素化反應(yīng)。底物蛋白可經(jīng)此反應(yīng)形成單泛素化、多泛素化及多聚泛素化以行使不同的功能[5]。在人類基因組中，編碼E1的基因只有一種，編碼E2的基因約40種，而編碼E3的基因超過600種[6，7]。作為UPS中最關(guān)鍵的酶，E3連接酶被分為三個家族：RING（really interesting new gene）家族、HECT（the homology to E6AP C terminus）家族和 RBR（the RING-between-RING）家族。RING家族可催化泛素從E2轉(zhuǎn)移到蛋白分子上[8]，而HECT家族和RBR家族則先將泛素轉(zhuǎn)移到E3活化半胱氨酸位點(diǎn)，再催化泛素與底物蛋白結(jié)合[9]。

E3連接酶呈組織特異性分布，肌肉組織（包括心肌、平滑肌、骨骼?。┲杏袃煞N特異性E3連接酶：MuRF1（muscleRING finger1，MuRF1）和 MAFbx（muscle atrophy F-box protein，MAFbx/Atrogin-1）。MuRF1是一種RING finger型E3連接酶，屬于TRIM超家族的亞群之一，其特征是存在NH2-末端三聯(lián)基序：RING結(jié)構(gòu)域、鋅指B盒結(jié)構(gòu)域和富含亮氨酸的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域[5]。MAFbx與MuRF1同屬于Cullin-Ringbased E3-Ligases（CRLs），是一種SCF蛋白復(fù)合物。在其結(jié)構(gòu)中，F(xiàn)-box發(fā)揮特異性識別作用，能使特定底物蛋白與E2相互作用，完成底物蛋白的泛素化[10]。Cullin是SCF復(fù)合物中的骨架蛋白，連接Skp和小RING finger結(jié)構(gòu)域Rbx1（RING-box protein1），促使泛素共價結(jié)合到底物蛋白的賴氨酸殘基[8]。26S蛋白酶體是分子量為2.0 MDa的多亞基蛋白酶，可識別多聚泛素化的底物蛋白，大量存在于胞漿和胞核內(nèi)，占細(xì)胞內(nèi)總蛋白質(zhì)的1%左右，主要由20S蛋白酶體和19S調(diào)節(jié)復(fù)合物組成。19S調(diào)節(jié)復(fù)合物可展開底物蛋白的三級結(jié)構(gòu)，將其轉(zhuǎn)移到20S蛋白酶體降解為2～10氨基酸的多肽。最終，蛋白水解酶將小分子多肽徹底降解為氨基酸。

2 泛素-蛋白酶體在運(yùn)動調(diào)節(jié)骨骼肌代謝中的作用

2.1 UPS與PGC- 1 α

過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator 1，PGC-1α）屬核轉(zhuǎn)錄輔助激活因子，廣泛存在于線粒體含量豐富的組織，如心肌、骨骼肌、肝臟、棕色脂肪組織（brown adipose tissue，BAT）等。在真核細(xì)胞中，PGC-1α起到促進(jìn)線粒體生物合成、糖和脂肪酸氧化代謝的作用。研究發(fā)現(xiàn)，PGC-1α敲除小鼠表現(xiàn)出骨骼肌細(xì)胞線粒體數(shù)目減少、運(yùn)動能力下降，骨骼肌易疲勞，并且適應(yīng)性產(chǎn)熱（non-shivering thermogenesis）能力嚴(yán)重受損[11]。PGC-1α還可促進(jìn)核呼吸因子1和2的表達(dá)（nuclear respiratory factor 1 and 2，Nrf1&Nrf2），從而增加線粒體轉(zhuǎn)錄因子（mitochondrial transcription factor A，mtTFA）和線粒體呼吸鏈相關(guān)蛋白表達(dá)，調(diào)節(jié)線粒體的生成[12]。作為細(xì)胞能量供應(yīng)站，線粒體是細(xì)胞內(nèi)葡萄糖、脂肪代謝的關(guān)鍵場所。骨骼肌細(xì)胞過表達(dá)PGC-1α-b（PGC-1α的一種主要亞型）可促使小鼠骨骼肌細(xì)胞線粒體生成增加，脂肪酸受體CD36、肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1（carnitine palmitoyltransferase 1，CPT1）等脂代謝關(guān)鍵蛋白均顯著增高，脂代謝增強(qiáng)，小鼠最大攝氧量和運(yùn)動速度也顯著提高[13]。

最新研究表明，UPS可調(diào)控骨骼肌細(xì)胞PGC-1α的含量，而耐力運(yùn)動增加PGC-1α蛋白表達(dá)可能與其蛋白穩(wěn)定性增加、UPS降解PGC-1α減少有關(guān)[14，15]。研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)過氧化物酶體增殖物激活受體β（peroxisome proliferator-activated receptor-β，PPARβ）顯著增加了細(xì)胞線粒體總量和PGC-1α含量，而PGC-1α基因表達(dá)量并無顯著變化[16]。Koh等采用電穿孔技術(shù)在脛骨前肌細(xì)胞中導(dǎo)入過表達(dá)PPARβ質(zhì)粒后發(fā)現(xiàn)，脛骨前肌PGC-1α與泛素分子結(jié)合顯著降低，PGC-1α蛋白含量顯著增加[14]。離體C2C12肌原細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)的PPARβ大量結(jié)合到PGC-1α，有效減少了PGC-1α與泛素結(jié)合[14]。上述結(jié)果提示PPARβ通過減少UPS對PGC-1α降解，增加了PGC-1α蛋白含量。為驗(yàn)證運(yùn)動在調(diào)節(jié)PPARβ/PGC-1α中的作用，研究人員對大鼠進(jìn)行為期2周的游泳運(yùn)動干預(yù)，運(yùn)動結(jié)束24h后檢測骨骼肌相關(guān)蛋白，發(fā)現(xiàn)骨骼肌PPARβ增加2.5倍，PGC-1α、線粒體酶、Nrf1也隨之增加。然而，抑制骨骼肌PPARβ后，線粒體酶和Nrf1顯著降低，PGC-1α蛋白含量降低了50%～70%[14]。

綜上所述，PGC-1α在細(xì)胞能量代謝過程中發(fā)揮重要作用，而UPS可調(diào)節(jié)PGC-1α蛋白含量，運(yùn)動可能通過增加PPARβ與PGC-1α結(jié)合、防止UPS降解PGC-1α，從而發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞線粒體生物合成，調(diào)節(jié)骨骼肌細(xì)胞能量代謝的作用。

2.2 UPS與HDAC 4/ 5

組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）分為4類，其中第Ⅱ類HDACs又分為a型和b型兩種亞型，HADC4/5/7/9屬于a型，而HDAC6及HDAC10屬于b型。研究發(fā)現(xiàn)組蛋白乙?；揎椗c染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控密切相關(guān)：乙酰化程度低的組蛋白區(qū)域，染色質(zhì)表現(xiàn)為緊湊、非轉(zhuǎn)錄激活狀態(tài)；而在常染色質(zhì)高度乙酰化的組蛋白區(qū)域則呈現(xiàn)出松散、轉(zhuǎn)錄活躍的狀態(tài)[17]。HDAC4/5等Ⅱ類a型HDACs單獨(dú)存在時并沒有去乙?；富钚裕枰ㄟ^C端去乙?；附Y(jié)構(gòu)域募集擁有催化活性的HDAC3復(fù)合物來行使其功能[18]。研究發(fā)現(xiàn)，在運(yùn)動調(diào)控骨骼肌糖代謝過程中，HDAC4/5起到重要作用，骨骼肌中特異性敲除HDAC4/5會引起Ⅰ型肌纖維（氧化型）顯著增加，小鼠抗疲勞能力增強(qiáng)[2]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其機(jī)制可能是與下調(diào)的HDAC4/5解除了對肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2（myocyte enhancer factor 2，MEF2）DNA序列結(jié)合區(qū)的抑制作用有關(guān)[2]。MEF2是骨骼肌細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子4（glucose transporter 4，Glut4）基因的重要啟動子之一，而Glut4是骨骼肌細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的關(guān)鍵蛋白，Glut4的缺失或功能障礙會導(dǎo)致細(xì)胞糖穩(wěn)態(tài)失調(diào)，引發(fā)胰島素抵抗（insulin resistance，IR）、T2DM 等疾病[19，20]。我們的前期研究也證明，運(yùn)動可通過激活腺苷酸活化蛋白激酶α2（AMP-activated protein kinase α2，AMPKα2） 抑制 HDAC4/5，促進(jìn)Glut4向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位，進(jìn)而改善IR[21]。

有氧運(yùn)動可能通過兩種機(jī)制對HDAC4/5進(jìn)行調(diào)控：一種是依賴于運(yùn)動激活骨骼肌細(xì)胞內(nèi)一些激酶磷酸化HDAC4/5介導(dǎo)的出核作用；另一種可能是促進(jìn)UPS對HDAC4/5的降解作用[2，18]。研究人員發(fā)現(xiàn)在慢肌纖維中Ⅱ型HDACs半衰期（Half-life）較短[2]。為探明其機(jī)制，研究人員在體外培養(yǎng)的C2C12肌細(xì)胞中加入環(huán)己酰亞胺（cycloheximide，一種蛋白合成抑制劑），4小時后發(fā)現(xiàn)相比于對照組HDAC5含量顯著降低，而加入MG132（蛋白酶體抑制劑）后，HDAC5的降解作用被顯著抑制，HDAC4/5的泛素化水平顯著提高，逆轉(zhuǎn)了HDAC5的下降，提示UPS降解HDAC5。研究人員隨后用一種HDAC5的核定位信號（nuclear localization signal，NSL）突變體HDAC5-K270R重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，其泛素化水平和蛋白水平并沒有變化。而在融合了SV40-核定位信號（SV40-NSL）后，HDAC5-K270R恢復(fù)了核轉(zhuǎn)位功能，泛素化水平再次升高。上述研究提示Ⅱ型HDACs是運(yùn)動調(diào)控骨骼肌糖代謝的重要靶點(diǎn)，運(yùn)動可通過激活激酶減少Ⅱ型HDACs對DNA的抑制作用，而UPS也可能起到協(xié)同作用，從而促進(jìn)MEF2和Glut4基因表達(dá)，改善骨骼肌糖攝取能力和IR。

3 調(diào)節(jié)骨骼肌泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的信號通路

3.1 FoxO 1/ 3

人體骨骼肌細(xì)胞叉頭框O家族蛋白（forkhead box class O family proteins，F(xiàn)oxOs）是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子家族，分為四種亞型，即 FoxO1、FoxO3、FoxO4、FoxO6。其中FoxO1/3是骨骼肌細(xì)胞蛋白質(zhì)降解的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可調(diào)控細(xì)胞UPS及自噬-溶酶體途徑（autophagy-lysosomal pathway）[22]。研究證實(shí)，F(xiàn)oxO1和3是骨骼肌特異性E3連接酶MuRF1和MAFbx的轉(zhuǎn)錄因子[23，24]。在過表達(dá)FoxO1的小鼠骨骼肌細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)，參與調(diào)控肌萎縮的相關(guān)基因表達(dá)均顯著增高，骨骼肌質(zhì)量丟失，導(dǎo)致運(yùn)動能力受損[23]。而在禁食誘導(dǎo)骨骼肌萎縮模型中，研究人員用電穿孔技術(shù)將RNAi導(dǎo)入骨骼肌細(xì)胞，抑制骨骼肌細(xì)胞FoxO1/3表達(dá)，小鼠骨骼肌萎縮顯著改善，同時MAFbx的表達(dá)抑制[24]。阿霉素（doxorubicin，DOX）是臨床常用的抗癌藥物，長期使用會對心肌和骨骼肌帶來的嚴(yán)重副作用。在DOX誘導(dǎo)的小鼠骨骼肌萎縮動物模型發(fā)現(xiàn)運(yùn)動可對抗DOX引起的骨骼肌萎縮，且降低心肌和骨骼肌細(xì)胞FoxO1和MuRF1的表達(dá)[25]。推測FoxOs可能是調(diào)控骨骼肌細(xì)胞蛋白分解代謝的重要因子，有望作為今后相關(guān)藥物開發(fā)的潛在靶點(diǎn)。

3.2 活性氧簇（reactive oxygen species ，ROS）

ROS是細(xì)胞在有氧代謝過程中產(chǎn)生的一系列活性氧簇，包括O2、H2O2、O2-、·OH等。線粒體是細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的重要場所。葡萄糖等營養(yǎng)物質(zhì)通過有氧氧化途徑進(jìn)入三羧酸循環(huán)，在代謝過程中產(chǎn)生的氫離子在線粒體呼吸鏈蛋白的作用下進(jìn)一步生成ATP和水，同時產(chǎn)生ROS[3]。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠制動所引起的比目魚肌萎縮與血漿ROS含量增加有關(guān)，給予ROS抑制劑別嘌呤醇治療明顯抑制p38絲裂原活化蛋白激酶-MAFbx（p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK）和核因子-κB-MuRF-1（Nuclear factor-kappa B，NF-κB）兩條信號通路的活性，在此過程中比目魚肌的萎縮程度減少了20%[26]。此外，單次高強(qiáng)度運(yùn)動可顯著提高小鼠腓腸肌脂質(zhì)過氧化物丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，增加機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)。而腹腔注射抗氧化劑Trolox可逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)，MAFbx、MuRF1 mRNA表達(dá)水平降低，減少了骨骼肌泛素連接酶的表達(dá)[27]。綜上所述，ROS可能是激活骨骼肌細(xì)胞UPS的重要因素，減少ROS可有效抑制UPS的作用效果。

3.3 腫瘤壞死因子-NF- κ B途徑

腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor alpha，TNFα）和NF-κB是細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)及凋亡的重要因子。在膽道梗阻性肝炎小鼠模型中，小鼠骨骼肌MAF-bx和MuRF-1 mRNA含量顯著增高，伴隨著肌球蛋白重鏈泛素化增多、20S蛋白酶體的活性也增高，骨骼肌出現(xiàn)明顯萎縮[28]。而小鼠被注射TNFα受體抑制劑后MAFbx和MuRF1 mRNA顯著降低，骨骼肌萎縮得到改善，提示TNFα是MAFbx和MuRF1的上游信號分子。肥胖機(jī)體處于長期慢性炎癥狀態(tài)，而有氧運(yùn)動能夠有效改善肥胖等代謝相關(guān)疾病。臨床研究發(fā)現(xiàn)，讓心衰患者進(jìn)行運(yùn)動治療后可顯著降低骨骼肌細(xì)胞TNFα、IL-6、IL-1β水平，減少骨骼肌炎癥狀態(tài)、改善心衰患者的骨骼肌萎縮[29]。TNFα也可增加鼠類同源泛素結(jié)合酶E220k（ubiquitin carrier protein and homologue of murine E220k，UbcH2）的表達(dá)，研究人員在UbcH2的啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)NF-κB結(jié)合位點(diǎn)，提示TNFα -NF-κB通路可調(diào)節(jié)UbcH2表達(dá)[30]。以上結(jié)果說明在炎癥狀態(tài)下TNFα可激活骨骼肌UPS，引起骨骼肌萎縮，而抑制其活性可改善骨骼肌質(zhì)量。

4 小結(jié)

蛋白質(zhì)是細(xì)胞生命功能的單位，UPS作為細(xì)胞內(nèi)降解蛋白質(zhì)的重要途徑調(diào)控細(xì)胞代謝相關(guān)蛋白質(zhì)的降解。MAFbx/MuRF1是骨骼肌細(xì)胞特異性E3連接酶，在骨骼肌萎縮發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。目前在骨骼肌細(xì)胞尚未完全發(fā)現(xiàn)E3連接酶的靶蛋白，篩選靶蛋白的相應(yīng)E3連接酶也是研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)之一。作為機(jī)體重要的代謝組織，揭示骨骼肌細(xì)胞代謝相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)機(jī)制可為今后肥胖、T2DM等代謝相關(guān)疾病的治療提供新的思路。