鄧麗 向小聰 張若蘭 劉康 馮剛

我國是食管癌的高發(fā)區(qū)，年平均死亡人數(shù)約15萬，占全國腫瘤死亡率21.8%[1]，由于細胞侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥的產(chǎn)生使目前該病的主要治療方法，即聯(lián)合性的綜合治療，療效不甚樂觀，食管癌的死亡率處于很高的水平[2-4]。因此，探尋食管癌的發(fā)生機制、尋找其早期腫瘤標(biāo)志物對于提高該病的早期診斷及治療具有重要意義。腫瘤干細胞作為腫瘤細胞群體中數(shù)量極少且特殊的一部分細胞，它們有完成細胞自我更新及分化、成瘤性強和抗凋亡等特性，在腫瘤的發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[5]。腫瘤干細胞對臨床上常用的放化療極為敏感且耐受性強，因此它們是引起腫瘤復(fù)發(fā)及耐藥性形成的重要原因之一，也是導(dǎo)致治療最終失敗的重要因素，因而如果能提出針對食管癌干細胞的基因治療手段，就有望實現(xiàn)對食管癌的控制。

胚胎干細胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子OCT3/4、SOX2以及NANOG等是維持干細胞自我更新、調(diào)控細胞分化的關(guān)鍵因素[6]。大量的實驗數(shù)據(jù)表明，轉(zhuǎn)錄因子NANOG在乳腺癌等多種腫瘤干細胞中高表達，同時各功能性實驗也證明了在多種腫瘤組織中NANOG的異常表達與腫瘤浸潤、侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7-8]，但截至目前為止，它與食管癌干細胞自我更新間的關(guān)系還未見詳細報道。因此，本研究擬通過懸浮培養(yǎng)法分離培養(yǎng)食管癌干細胞，并通過基因沉默技術(shù)研究NANOG的表達與食管癌干細胞增殖間的關(guān)系。

材料與方法

一、材料

NANOG1、2、NC-shRNA購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司，NANOG、GAPDH、CD133等引物均由成都豪乙生物科技有限公司合成，免疫印跡蛋白實驗（Western-Blot）中相關(guān)試劑均購自美國Thermo公司，嘌呤霉素、Lipofectamine 2000、RNA提取試劑Trizol、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑、qPCR Mix均購自美國Invitrogen公司，活死細胞染色試劑購自美國AAT Bioquest公司，細胞因子β-FGF、EGF購自美國PeproTech公司，DMEM/F12、細胞生長添加成分B27購自美國Gibco公司，胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基、100X雙抗添加劑、0.25%胰蛋白酶均購自美國HyClone公司，NANOG、GAPDH抗體購自美國SANTA CRUZ公司，CD133抗體購自英國Abcam公司，人食管鱗癌細胞系Eca-109為川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗中心凍存。

二、方法

1.懸浮培養(yǎng)法分離食管鱗癌干細胞并檢測：復(fù)蘇培養(yǎng)Eca-109食管鱗癌細胞，以含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。待細胞處于對數(shù)生長期，將其消化傳代并以無血清培養(yǎng)基（serumfree medium，SFM）重懸，1×105/ml密度接種于低黏附性10 cm培養(yǎng)板中，待食管鱗癌腫瘤干細胞增殖形成腫瘤干細胞球，6 ～ 8 d后，將其收集并機械吹打成單細胞懸液，重懸于SFM，按1 ： 5比例傳代于10 cm培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)、進一步純化形成食管鱗癌腫瘤干細胞球。SFM培養(yǎng)基成分：DMEM/F12為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加B27（1 ： 50）、EGF（20 ng/ml）、β-FGF（20 ng/ml）生長因子。

分別提取成球前后細胞總RNA（逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA）和蛋白，進行RT-PCR和Western-Blot檢測細胞中腫瘤干細胞標(biāo)志物CD133、CD44分子及蛋白水平的表達。mRNA表達量，實驗結(jié)果以GAPDH作為內(nèi)參照，實驗測得數(shù)據(jù)用2-ΔΔCt分析法進行分析計算。CD133上游引物序列：5'-ACAA TTCACCAGCAACGAGTCC-3'；CD133下游引物序列：5'-GACGCTTTGGTATAGAGTGCTCAG-3'；CD44上游引物序列：5'-AGACAACCACAAGGA TGACTGATG-3'；CD44下游引物序列：5'-TCCAG TTTCCTTCATAAGCAGTGG-3'；GAPDH上游引物：5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3'；GAPDH下游引物：5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'。Western-Blot法檢測蛋白表達：提取總蛋白并進行蛋白定量。聚丙烯酰胺凝膠電泳法進行蛋白分離。PVDF膜電轉(zhuǎn)移后，封閉45 min，加入CD133、CD44和GAPDH一抗抗體，4 ℃過夜后洗滌，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗抗體。增強化學(xué)發(fā)光顯色，膠片曝光檢查蛋白表達水平，以GAPDH作為內(nèi)參照。每組實驗重復(fù)3次。

2.細胞轉(zhuǎn)染和分組培養(yǎng)：懸浮培養(yǎng)得到的食管鱗癌干細胞分為如下3組，按照說明書要求，以脂質(zhì)體2000作為基因載體進行轉(zhuǎn)染：（1）無靶向mRNA的對照（NC）組；（2）靶向沉默NANOG的1號質(zhì)粒（sh-N1）組；（3）靶向沉默NANOG的2號質(zhì)粒（sh-N2）組。Sh-N1靶向序列：5'-TAAACTAC TCCATGAACAT-3'；sh-N2靶向序列：5'-TGGAACA GTCCCTTCTATA-3'。各組轉(zhuǎn)染后，培養(yǎng)24 h后用含2.5 μg/ml嘌呤霉素的篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)48 ～ 72 h用于后續(xù)實驗。

3. NANOG基因沉默及CD133、CD44表達檢測：提取方法2中轉(zhuǎn)染并篩選培養(yǎng)后細胞的總RNA（逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA）和蛋白，進行RT-PCR和Western-Blot檢測NANOG的表達是否被有效敲低。并進一步檢測腫瘤干細胞標(biāo)志物CD133、CD44的表達變化。實驗結(jié)果以GAPDH作為內(nèi)參照，實驗測得數(shù)據(jù)用2-ΔΔCt分析法進行分析計算。NANOG上游引物：5'-ACCTATGCCTGTGATTTGTGG-3'；下游引物：5'-AGTGGGTTGTTTGCCTTTGG-3'。Western-Blot方法同1，一抗抗體分別為NANOG和CD133。

4.細胞增殖能力檢測：取方法2中各組轉(zhuǎn)染并篩選后的細胞，各實驗組以2×104個細胞/孔重懸于200 μl培養(yǎng)基中，接種于96孔板。分組繼續(xù)培養(yǎng)24，48，72和96 h后分別加入CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，酶標(biāo)儀測量450 nm波長的各孔吸光度（A）值。所有實驗重復(fù)3次。

5.活死細胞染色：取方法2中各組轉(zhuǎn)染并篩選后的細胞以及75%酒精（EtOH）孵育30 min的凋亡對照組細胞，消化、重懸將細胞接種于六孔板中，培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞3 ～ 5次，配置終濃度為1 μmol/L和2 μmol/L的Calcein-AM和PI染色液，500 μl染色液/孔加入細胞中，置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育15 min，顯微鏡下觀察并拍照記錄。

6.腫瘤干細胞球形成能力檢測：取方法2中各組轉(zhuǎn)染并篩選后的細胞，將其消化傳代并重懸于SFM，同方法1中步驟進行腫瘤干細胞成球培養(yǎng)。拍照并對形成的細胞球計數(shù)，整理數(shù)據(jù)比較NANOG表達水平的高低與食管鱗癌腫瘤干細胞成球間的關(guān)系。

三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。RT-PCR表達水平、CCK-8實驗測得A值、腫瘤干細胞球形成數(shù)量實驗數(shù)據(jù)采用±s表示，組間比較采用單因素方差分析和t檢驗。以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、懸浮培養(yǎng)法富集Eca-109腫瘤干細胞球

以無血清的DMEM/F12作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加EGF、β-FGF、B27生長因子，并輔以低黏細胞培養(yǎng)板降低食管鱗癌細胞的貼壁性。利用該條件從Eca-109食管鱗癌細胞系中成功獲得懸浮生長的腫瘤干細胞球，并可以連續(xù)傳代，如圖1。RT-PCR實驗結(jié)果顯示，與未分離的貼壁細胞相比（1.03±0.02，1.02±0.02），Eca-109干細胞球的腫瘤干細胞標(biāo)志物CD133、CD44表達明顯增強（10.12±0.19，9.21±0.26），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01）。Western-Blot實驗與RT-PCR結(jié)果一致。結(jié)果如表1、圖2。

表1 兩組Eca-109細胞CD133、CD44表達量（±s）

表1 兩組Eca-109細胞CD133、CD44表達量（±s）

注：實驗重復(fù)3次

分組CD133CD44

圖1 光學(xué)顯微鏡下觀察懸浮培養(yǎng)法獲得的Eca-109腫瘤干細胞球（×100）

圖2 Western Blot檢測Eca-109 干細胞分離前后CD133、CD44蛋白表達水平

二、三組食管鱗癌腫瘤干細胞中NANOG表達水平比較

RT-PCR實驗檢測發(fā)現(xiàn)，NANOG沉默質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（sh-N1、sh-N2）食管鱗癌腫瘤干細胞中NANOG的相對表達水平（0.18±0.01，0.23±0.01）較對照（NC）組（1.03±0.02）下調(diào)，即NANOG shRNA有效沉默其mRNA表達，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01）。Western-Blot檢測與RT-PCR結(jié)果一致，NANOG shRNA有效沉默了NANOG蛋白水平的表達，如圖3所示。

三、NANOG敲低抑制食管鱗癌腫瘤干細胞增殖

CCK-8實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，sh-N1、sh-N2組Eca-109干細胞于24、48、72、96 h測得的A值分別為（0.33±0.02，0.52±0.04，0.61±0.06，0.81±0.03），（0.33±0.02，0.45±0.04，0.53±0.04，0.72±0.07），增殖能力低于NC組（0.90±0.01，1.41±0.01，2.31±0.02，3.12±0.07），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01，表2）。同時，以酒精處理為陽性對照組的活死細胞染色實驗結(jié)果表明，NANOG敲低并未引起細胞凋亡，如圖4所示。結(jié)果提示：NANOG敲低使Eca-109腫瘤干細胞增殖能力明顯降低。

四、NANOG敲低抑制食管鱗癌細胞干細胞球形成能力

圖3 Western Blot檢測NANOG shRNA轉(zhuǎn)染Eca-109干細胞后NANOG的蛋白表達水平

對Eca-109腫瘤干細胞進行NANOG敲低操作后，在懸浮培養(yǎng)的條件下，sh-N1、sh-N2組富集腫瘤干細胞、形成腫瘤干細胞球的能力（12±1，16±2）低于對照NC組（80±3），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

討 論

食管癌在世界范圍內(nèi)是常見性的惡性腫瘤，并且仍在持續(xù)蔓延。據(jù)統(tǒng)計，其5年生存率僅20%左右，中國年發(fā)患者數(shù)占全球總發(fā)病的60%[9-10]。目前，臨床上治療食管癌以根治性手術(shù)、放療、化療以及中醫(yī)藥治療為主要治療手段，并已取得了一定的治療效果，然而化療后細胞耐藥性出現(xiàn)，并進一步導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)等現(xiàn)象極為常見，這與腫瘤干細胞的存在密切相關(guān)。越來越多的研究在乳腺癌、前列腺癌、腦神經(jīng)瘤等惡性腫瘤中分離得到腫瘤干細胞，并證實它們參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[11-13]。隨著對腫瘤干細胞認識的深入，針對腫瘤干細胞進行治療以抑制腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的治療模式越來越受到重視。目前，對腫瘤干細胞的鑒定多依賴其表面標(biāo)志物，CD133、CD44是兩種被廣泛認可的人腫瘤干細胞標(biāo)志物[14-16]。本研究采用懸浮培養(yǎng)的方法分離Eca-109食管鱗癌干細胞，經(jīng)過流式細胞術(shù)測定，培養(yǎng)所形成的腫瘤干細胞球CD44、CD133的陽性率高達85.2%和91%，表明該方法高效地分離出食管鱗癌干細胞。

表2 三組Eca-109干細胞CCK-8實驗測得的（A）值比較（±s）

表2 三組Eca-109干細胞CCK-8實驗測得的（A）值比較（±s）

注：實驗重復(fù)3次

分組24 h48 h72 h96 h NC組0.90±0.011.41±0.012.31±0.023.12±0.07 sh-N1組0.33±0.020.52±0.040.61±0.040.81±0.03 sh-N2組0.33±0.020.45±0.040.53±0.040.72±0.07 F值1121.33525.731022.161198.29 P值＜ 0.01＜ 0.01＜ 0.01＜ 0.01

圖4 熒光顯微鏡下觀察NANOG敲低后細胞存活及凋亡情況（Calcein-AM/PI活死細胞染色，×100）

NANOG是維持胚胎干細胞自我更新最為靈敏的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子之一，被視為胚胎干細胞重要的“看門人”，其表達量一旦下調(diào)就會導(dǎo)致細胞分化[17-19]。腫瘤細胞，尤其是低分化腫瘤細胞，與干細胞相似，具有自我更新和分化增殖的能力，在多種惡性腫瘤的研究中均發(fā)現(xiàn)NANOG參與腫瘤干細胞調(diào)控，并在腫瘤的侵襲、遷移及耐藥中發(fā)揮重要作用[19]。研究者發(fā)現(xiàn)NANOG在食管癌等多種惡性腫瘤細胞中高表達，同樣，在食管鱗癌中也分離出得到腫瘤干細胞[8][20]，但NANOG在食管鱗癌干細胞中的作用尚不明確。本研究利用RNA干擾技術(shù)，將NANOG作為靶點對食管鱗癌干細胞的功能進行干預(yù)。

本研究采用NANOG 短發(fā)夾RNA（shRNA）轉(zhuǎn)染Eca-109食管鱗癌干細胞，以探究它對食管鱗癌干細胞增殖的影響。筆者首先通過RTPCR和Western-Blot實驗檢測轉(zhuǎn)染后各組細胞中NANOG的mRNA及蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)與對照（NC組）相比，所采用的NANOG shRNA有效的降低了細胞中NANOG的表達水平?；诖耍狙芯窟M一步采用CCK-8實驗檢測食管鱗癌干細胞增殖能力，同時采用懸浮培養(yǎng)方法檢測細胞成球能力。實驗結(jié)果表明，與對照（NC組）相比，轉(zhuǎn)染NANOG shRNA后的食管鱗癌干細胞增殖和成球能力明顯減弱。既往研究也表明，NANOG在膠質(zhì)細胞瘤等多種惡性腫瘤中高表達，并在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的積極作用[8][21-22]。

綜上所述，敲低NANOG對Eca-109食管鱗癌干細胞的增殖具有明顯的抑制效果，有望成為針對食管鱗癌的有效靶向性治療靶點，提高食管鱗癌基因治療效果。

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