胰腺癌惡性程度極高，5年生存率僅6%，被稱為“癌中之王”［1］。近期腫瘤免疫學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)展，對審視胰腺癌惡性行為的內(nèi)在機(jī)制以及尋求新的防控策略提供了新思路。免疫微環(huán)境重塑在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［2］。特殊的腫瘤微環(huán)境為胰腺癌的免疫治療帶來挑戰(zhàn)。首先胰腺癌細(xì)胞缺乏免疫原性抗原表達(dá)，其主要組織相容性抗原（MHC）Ⅰ類分子顯著下調(diào)；其次具有抗腫瘤作用的效應(yīng)性T細(xì)胞、Th1型、NK細(xì)胞、DC細(xì)胞以及TAMs（M1）數(shù)量減少，活性下降，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）、Th2型、MDSCs以及TAMs（M2）等抑制性免疫細(xì)胞聚集［3］；同時(shí)微環(huán)境中存在TGF-β1、IL-10、IL-35、CCL5、CXCL12等眾多免疫調(diào)節(jié)因子共同形成胰腺癌免疫抑制的微環(huán)境。本文旨在通過綜述Treg細(xì)胞參與腫瘤免疫微環(huán)境重塑的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)化研究新進(jìn)展，尋求在腫瘤免疫學(xué)水平的胰腺癌診治新思路，為胰腺癌免疫調(diào)節(jié)治療提供新策略。

1 Treg細(xì)胞概述

1.1 Treg細(xì)胞定義

Treg細(xì)胞是一類可以調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞功能的T細(xì)胞亞群，主要通過抑制T細(xì)胞的活化，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)及誘導(dǎo)免疫耐受作用。Treg細(xì)胞最初定義基于CD4+T細(xì)胞中IL-2受體α鏈（CD25）的組成性高表達(dá)，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)也表達(dá)細(xì)胞毒性T細(xì)胞相關(guān)抗原4（CTLA-4）以及TNF受體家族相關(guān)基因（glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor，GITR），而轉(zhuǎn)錄因子FOXP3基因的表達(dá)對Treg細(xì)胞的發(fā)育成熟以及發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用至關(guān)重要［4］。

1.2 Treg細(xì)胞分類及功能

固有型 Treg細(xì)胞（natural T regulatory cells，nTreg）起源于胸腺，持續(xù)表達(dá)FOXP3，主要通過細(xì)胞接觸作用發(fā)揮免疫抑制；誘導(dǎo)型Treg細(xì)胞（induced T regulatory cells，iTreg）對T細(xì)胞抗原識別受體的刺激高度敏感，繼而分泌TGF-β1等細(xì)胞因子抑制免疫活性；腫瘤微環(huán)境中，固有Treg細(xì)胞與誘導(dǎo)型Treg細(xì)胞的表型及作用可發(fā)生改變并相互轉(zhuǎn)化［5］。在生理情況下，Treg細(xì)胞在保持免疫系統(tǒng)平衡，避免自身免疫性疾病、過敏反應(yīng)以及移植排斥反應(yīng)中起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用［6］。在腫瘤患者中，Treg細(xì)胞是參與腫瘤免疫應(yīng)答抑制的重要成分，可直接抑制CD4+T和CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞以及DC細(xì)胞的功能，其在瘤體及外周血中的數(shù)量呈增多狀態(tài)且預(yù)后不良［7］，但其增多的機(jī)制尚未完全闡明，其參與腫瘤免疫微環(huán)境重塑，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的潛在機(jī)制仍有待深入的研究。

2 Treg細(xì)胞與胰腺癌

2.1 Treg細(xì)胞分布與胰腺癌患者臨床預(yù)后的關(guān)系

Hiraoka等［8］首次報(bào)道利用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，在不同級別胰腺導(dǎo)管上皮內(nèi)瘤變、胰腺導(dǎo)管腺癌組織以及腫瘤引流淋巴結(jié)中顯示CD4+CD25+FOXP3+的Treg細(xì)胞浸潤情況，結(jié)果表明胰腺癌局部間質(zhì)中Treg細(xì)胞的數(shù)量顯著增加，癌前病變演進(jìn)過程中Treg細(xì)胞數(shù)量也逐漸增多，并與腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤分級及臨床分期相關(guān)。Tang等［9］研究發(fā)現(xiàn)，正常胰腺組織無Treg細(xì)胞浸潤，而癌組織中浸潤的Treg細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞均顯著增加，且癌周Treg細(xì)胞浸潤更多，浸潤Treg細(xì)胞與浸潤C(jī)D4+T細(xì)胞呈正比，與浸潤C(jī)D8+T細(xì)胞呈反比。Liu等［10］結(jié)合臨床病理數(shù)據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，Treg細(xì)胞浸潤與胰腺癌腫瘤去分化顯著呈相關(guān)，但與轉(zhuǎn)移及微血管侵襲無顯著相關(guān)性，Treg細(xì)胞浸潤數(shù)量可作為判斷預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素［10］。與健康人群相比，胰腺癌患者外周血Treg細(xì)胞數(shù)量增加，且與TNM分期呈顯著相關(guān)性，研究表明晚期胰腺癌患者可能與腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移存在密切聯(lián)系，分層分析在行根治切除手術(shù)的胰腺癌患者中，Treg細(xì)胞數(shù)升高組的生存期縮短［11］。胰腺癌一線化療藥物吉西他濱可以使患者外周血Treg水平下降，CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞的減少提示患者化療有效，患者生存期也相對較長［12］。Treg細(xì)胞不僅參與胰腺癌發(fā)生的各個(gè)階段，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，胰腺癌患者腫瘤組織和外周血Treg細(xì)胞的升高可以作為不良預(yù)后的標(biāo)記。

2.2 胰腺癌腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞浸潤增多的可能機(jī)制

2.2.1 外周血中CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞向腫瘤局部聚集 Treg細(xì)胞可被腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子所趨化。一方面，腫瘤細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子CCL5、CCL17、CCL22和CXCL9/10/11等，Treg細(xì)胞表面存在相關(guān)因子受體被趨化招募；另一方面，腫瘤源性血管內(nèi)皮細(xì)胞上的黏附因子可以與Treg細(xì)胞上的配體相互作用，使其在腫瘤局部集聚。Tan等［13］研究發(fā)現(xiàn)，CCR5在CD4+FOXP3+Treg細(xì)胞上高表達(dá)，動物實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用抑制劑阻斷CCR5信號，可以減少Treg細(xì)胞在胰腺癌腫瘤局部的浸潤。本課題組進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞高表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子FOXP3的胰腺癌患者，腫瘤微環(huán)境中浸潤的Treg細(xì)胞明顯高于低表達(dá)組，深入研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌細(xì)胞FOXP3可直接轉(zhuǎn)錄激活CCL5的表達(dá)，胰腺癌細(xì)胞通過分泌CCL5招募Treg細(xì)胞向腫瘤局部聚集［14］。此外有研究報(bào)道，胰腺癌細(xì)胞可誘導(dǎo)微環(huán)境中的星形細(xì)胞分泌CXCL10，并介導(dǎo)CXCR3+Treg細(xì)胞向腫瘤局部募集［15］。Chen等［16］通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)闡述了外周血循環(huán)來源的Treg細(xì)胞黏附并穿過腫瘤源性血管內(nèi)皮細(xì)胞向腫瘤組織浸潤的機(jī)制：腫瘤源性內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)黏膜上皮細(xì)胞黏附分子-1（MAdCAM-1）、血管細(xì)胞黏附-1（VCAM-1）、CD62-E，Treg細(xì)胞上特異性表達(dá)這些黏附分子的配體β7整合素以及CD62L，黏附分子與其對應(yīng)配體間的作用介導(dǎo)了Treg細(xì)胞的穿血管過程，特異性阻斷以上黏附分子可以使Treg細(xì)胞對腫瘤源性血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附能力下降，減少腫瘤局部Treg細(xì)胞的浸潤。

2.2.2 腫瘤微環(huán)境誘導(dǎo)產(chǎn)生iTregs 胰腺腫瘤微環(huán)境中癌細(xì)胞和其他間質(zhì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子如TGF-β1，使CD4+CD25-T細(xì)胞誘導(dǎo)成CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞［3］。有研究證明，加入CD3和CD28刺激伴隨TGF-β1存在的情況下可體外誘導(dǎo)出Foxp3+Treg細(xì)胞，同時(shí)研究者在Pan02小鼠胰腺癌模型中發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞通過分泌TGF-β1使得引流淋巴結(jié)中的iTregs增加，在Rag-/-小鼠中Pan02組可使CD4+CD25-Foxp3-Treg誘導(dǎo)為成熟的CD4+CD25+FOXP3+Treg，應(yīng)用TGF-β中和抗體可阻斷這一現(xiàn)象［17］。

2.2.3 腫瘤微環(huán)境固有或招募的Treg細(xì)胞的增殖 同樣是在Pan02細(xì)胞小鼠胰腺原位移植瘤體中，發(fā)現(xiàn)浸潤了大量的具有效應(yīng)/記憶表型的Treg細(xì)胞，應(yīng)用特異性TGF-β受體Ⅰ激酶抑制劑和CCR4阻斷劑并未完全逆轉(zhuǎn)腫瘤中浸潤Treg細(xì)胞的數(shù)量［18］，提示該群Treg細(xì)胞具有免疫抑制活性和高度增殖活性。腫瘤引流淋巴結(jié)中的DC細(xì)胞可以通過TGF-β依賴性方式促進(jìn)Treg細(xì)胞的增殖［19］。另有研究報(bào)道Treg細(xì)胞上PD-L1的表達(dá)也可促進(jìn)iTreg細(xì)胞增殖［20］。

2.3 Treg細(xì)胞通過多種途徑參與胰腺癌免疫微環(huán)境重塑

Treg細(xì)胞不僅可以抑制抗腫瘤免疫的活性，還可通過多種途徑協(xié)助腫瘤免疫微環(huán)境重塑，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞免疫逃避、促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。

2.3.1 Treg細(xì)胞直接發(fā)揮免疫微環(huán)境重塑作用 Chen等［21］研究發(fā)現(xiàn)，Treg細(xì)胞通過分泌抑制性免疫因子TGF-β抑制CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，介導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞免疫逃逸。Treg細(xì)胞分泌TGF-β同時(shí)可以抑制NK細(xì)胞功能，降低NK細(xì)胞表面NKG2D受體。清除人體以及小鼠Treg細(xì)胞可增強(qiáng)NK細(xì)胞的增殖、殺傷毒性及其介導(dǎo)的腫瘤識別。Treg細(xì)胞通過分泌IL-35減少抗腫瘤效應(yīng)淋巴細(xì)胞在瘤周組織的浸潤。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境中的IL-35可以刺激胰腺癌細(xì)胞分泌CCL5，進(jìn)而趨化單核巨噬細(xì)胞向腫瘤局部募集，進(jìn)一步誘導(dǎo)腫瘤新生血管的產(chǎn)生，與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［22］，同時(shí)還證實(shí)胰腺癌特殊的微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞被賦了類免疫細(xì)胞的生物學(xué)功能，協(xié)同腫瘤局部浸潤的Treg細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞共同發(fā)揮免疫抑制功能，并參與促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生［14］。Treg細(xì)胞通過分泌顆粒酶B及穿孔素直接誘導(dǎo)NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞凋亡?；蚬こ绦∈篌w內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，相比野生型小鼠，顆粒酶B缺陷荷瘤小鼠反而生存期更長，腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞通過顆粒酶B及穿孔素依賴的方式引起NK細(xì)胞和腫瘤相關(guān)效應(yīng)性CD8+T細(xì)胞的死亡［23］。

2.3.2 Treg細(xì)胞通過與其他免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞協(xié)同影響免疫微環(huán)境重塑 Treg細(xì)胞通過直接與APC接觸，改變細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytotoxic T cell，CTL）的狀態(tài)。應(yīng)用小鼠T細(xì)胞過繼治療模型研究發(fā)現(xiàn)，Treg細(xì)胞可誘導(dǎo)腫瘤浸潤T細(xì)胞出現(xiàn)耗竭狀態(tài)，表現(xiàn)為多種效應(yīng)性細(xì)胞因子的失活，同時(shí)PD-1、TIM3等共抑制受體的表達(dá)增加。深入的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，Treg細(xì)胞在局部微環(huán)境中通過短暫的抗原依賴方式與APC相互作用，形成與CD11c+APCs不穩(wěn)定的結(jié)合，顯著抑制APC上的CD80和CD86的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)CTL上PD-1及TIM3的表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)CTL的功能失調(diào)［24］。類似這一調(diào)節(jié)過程在DC細(xì)胞也被證實(shí)，通過阻斷Treg細(xì)胞上CTLA-4的表達(dá)，可逆轉(zhuǎn)DC細(xì)胞上CD80和CD86表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)CTL的耗竭狀態(tài)。與此同時(shí)，腫瘤局部的DC細(xì)胞又通過持續(xù)表達(dá)IL-2，激活Treg細(xì)胞，增強(qiáng)其介導(dǎo)的免疫抑制功能［25］。

總之，Treg細(xì)胞通過抑制CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及單核-巨噬細(xì)胞的分化和功能進(jìn)而抑制特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)，形成腫瘤免疫抑制微環(huán)境，參與腫瘤免疫逃逸。

2.4 靶向腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞-胰腺癌治療的新策略

靶向Treg細(xì)胞的基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化研究日益深入，針對Treg細(xì)胞在腫瘤患者中的特征，治療策略之一是減少其浸潤的數(shù)量，其次則是解除其抑制免疫應(yīng)答的功能。

2.4.1 應(yīng)用單克隆抗體抑制Treg細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能 Treg細(xì)胞表面的CTLA-4在其發(fā)揮免疫抑制調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用，CTLA-4中和抗體可誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的凋亡并降低抑制性信號。Ipilimumab（anti-CTLA-4）的Ⅱ期臨床試驗(yàn)顯示在黑色素瘤中療效顯著，但晚期胰腺癌患者對其無響應(yīng)［26］。胰腺癌中應(yīng)用anti-CTLA-4的其他臨床試驗(yàn)如NCT00836407、NCT00112580、NCT 01896869、NCT03104439、NCT02866383、NCT02834013正在招募。利用胰腺癌的動物模型，深入機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)對比常規(guī)全身大劑量應(yīng)用CTLA-4單克隆抗體，癌旁小劑量CTLA-4單克隆抗體可有效減小腫瘤體積，加大劑量后并未增加其抑瘤效果。相反高劑量全身性治療增加了次級淋巴節(jié)Treg細(xì)胞的浸潤，抵消了CTLA-4單克隆抗體抗腫瘤治療的作用［27］。

2.4.2 聯(lián)合治療方案抑制Treg細(xì)胞浸潤數(shù)量和免疫調(diào)節(jié)功能 Aida等［28］在胰腺癌動物模型中應(yīng)用IFN-α-腺病毒載體聯(lián)合anti-GITR單克隆抗體，可使瘤體體積顯著縮小。針對GITR的單克隆抗體可以有效抑制Treg細(xì)胞功能，增強(qiáng)抗機(jī)體腫瘤免疫。IFN-α可通過直接殺傷腫瘤細(xì)胞和增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答等多種途徑發(fā)揮作用，聯(lián)合anti-GITR單抗，可減少腫瘤組織中FOXP3+Treg細(xì)胞的浸潤，同時(shí)IFN-α-腺病毒載體可增加腫瘤中CD4+T和CD8+T細(xì)胞的浸潤數(shù)量。同時(shí)該研究提示anti-GITR單抗通過下調(diào)Treg細(xì)胞上CCR5表達(dá)的減少，減少其在腫瘤局部的浸潤聚集。研究表明，在動物實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用CCR5抑制劑（TAK-779），可顯著減少腫瘤組織中Treg細(xì)胞的浸潤，并抑制腫瘤的增長［13］。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，CCL-5/CCR5信號在胰腺癌腫瘤局部Treg細(xì)胞浸潤聚集過程中發(fā)揮重要作用。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌細(xì)胞高表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子FOXP3轉(zhuǎn)錄激活CCL-5表達(dá)，參與腫瘤局部Treg細(xì)胞的招募富集，使用CCL5單抗可以更加顯著地減少Treg細(xì)胞浸潤，而腫瘤細(xì)胞高表達(dá)FOXP3亦可作為該中和抗體的優(yōu)勢篩選標(biāo)記［14］。

應(yīng)用聯(lián)合治療方案清除腫瘤浸潤Treg細(xì)胞的臨床前研究也是一大熱點(diǎn)。IL-2α受體CD25是Treg細(xì)胞的一個(gè)干預(yù)靶點(diǎn)［29］。Viehl等［30］應(yīng)用C57BL/6小鼠皮下胰腺癌模型，對比放射法制備的Pan02全細(xì)胞瘤苗治療組，聯(lián)合應(yīng)用CD25單克隆抗體，可有效抑制腫瘤生長，延長荷瘤小鼠生存期。在另一項(xiàng)胰腺癌Pan02移植瘤模型實(shí)驗(yàn)中，研究者應(yīng)用胰腺癌細(xì)胞特異性抗原免疫激活復(fù)合物（ISCOM）疫苗，聯(lián)合CD25單克隆抗體以及TLR9激動劑CpG，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可顯著減少Treg細(xì)胞在腫瘤組織的浸潤，誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答并激活了免疫細(xì)胞，最終通過CD8+T細(xì)胞發(fā)揮抑制腫瘤進(jìn)展的作用［31］。在KPC胰腺癌模型鼠中應(yīng)用，轉(zhuǎn)入野生型Kras（G12D）的李斯特菌疫苗（LM-Kras）聯(lián)合抗CD25單克隆抗體及環(huán)磷酰胺，可抑制癌前病變發(fā)生，改善PanIN階段腫瘤局部的免疫抑制狀態(tài)，延緩胰腺癌的演進(jìn)過程［32］。CD25單克隆抗體聯(lián)合DC細(xì)胞疫苗或DC/TC融合瘤苗誘導(dǎo)NK細(xì)胞活性增強(qiáng)，同時(shí)給予清除Treg細(xì)胞后，淋巴細(xì)胞IFN-γ的分泌顯著增加，具有明顯抑瘤效果效果［33］。

2.4.3 靶向Treg細(xì)胞的臨床轉(zhuǎn)化研究 在臨床轉(zhuǎn)化方面，應(yīng)用地尼白介素（denileukin diftitox）聯(lián)合CEADC疫苗治療腫瘤患者，清除Treg細(xì)胞，顯著增強(qiáng)疫苗的抗腫瘤活動?，F(xiàn)已被FDA批準(zhǔn)在淋巴瘤、白血病和晚期伴有轉(zhuǎn)移的胰腺癌患者中進(jìn)行臨床試驗(yàn)［34］。Shevchenko等［18］在Pan02原位成瘤動物模型中，低劑量吉西他濱減少Tregs細(xì)胞的聚集，并延長生存。同樣Plassmeier等［35］在胰腺癌基因工程鼠中應(yīng)用阿司匹林聯(lián)合吉西他濱可延長生存期，減少Foxp3+Treg細(xì)胞的數(shù)量。在PC患者中以吉西他濱為主的化療減少外周循環(huán)系統(tǒng)中Treg細(xì)胞的比例以及絕對數(shù)量。在晚期轉(zhuǎn)移性胰腺癌中其他有關(guān)Treg細(xì)胞的治療如NCT02947165的Anti-TGF-β臨床試驗(yàn)正在招募中。

3 展望

Treg細(xì)胞是腫瘤免疫微環(huán)境重塑的重要參與者，其在腫瘤局部的聚集是導(dǎo)致抗腫瘤免疫應(yīng)答低下的重要原因之一。綜述現(xiàn)有研究進(jìn)展，通過多種途徑針對Treg細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，減少其在腫瘤局部浸潤數(shù)量，抑制Treg細(xì)胞功能有望增強(qiáng)聯(lián)合免疫治療的抗腫瘤效果，為包括胰腺癌在內(nèi)的多種實(shí)體腫瘤免疫調(diào)節(jié)治療帶來了希望。然而針對Treg細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)治療需要更加個(gè)體化，作為胰腺癌輔助治療的臨床應(yīng)用仍有待于進(jìn)一步的探討。在分子水平上進(jìn)一步明確Treg與腫瘤免疫微環(huán)境重塑的關(guān)系，尋找傳統(tǒng)治療與免疫治療的最佳契合點(diǎn)，將為胰腺癌乃至惡性腫瘤的聯(lián)合免疫治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和依據(jù)。