丁萬(wàn)軍 曾濤 郭衛(wèi)春

[摘要] 目的 觀察羧甲基殼聚糖（CMC）逆轉(zhuǎn)人骨肉瘤耐藥細(xì)胞株MG-63/ADM的耐藥作用并初步探討其機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)建立人骨肉瘤耐藥MG-63/ADM細(xì)胞株，MTT檢測(cè)其耐藥性；用不同濃度（50、100、200 μmol/L）CMC+阿霉素2.0 μg/mL作用于骨肉瘤MG-63/ADM細(xì)胞24、48、72 h后，采用MTT法測(cè)各組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率；采用Western blot方法檢測(cè)不同濃度CMC處理后MG-63/ADM細(xì)胞P糖原蛋白（P-gp）及胞核中核轉(zhuǎn)錄因子-κB P65（NF-κB P65）的表達(dá)水平。 結(jié)果 MTT結(jié)果顯示MG-63/ADM細(xì)胞株對(duì)阿霉素（ADM）明顯耐藥，IC50為（1.97±0.56）μg/mL，耐藥指數(shù)為11.35；CMC聯(lián)合ADM 2.0 μg/mL能明顯抑制MG-63/ADM細(xì)胞的增殖，且其抑制作用與CMC呈時(shí)間和劑量依賴(lài)性（P < 0.01）。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，MG-63/ADM細(xì)胞組較MG-63細(xì)胞組P-gp的表達(dá)水平明顯升高（P < 0.05），且用不同濃度CMC處理的MG-63/ADM細(xì)胞組P-gp表達(dá)均明顯低于MG-63/ADM細(xì)胞組（不加藥物）（P < 0.05）；MG-63/ADM細(xì)胞組較MG-63細(xì)胞組NF-κB P65的表達(dá)水平明顯升高（P < 0.05），且不同濃度CMC處理的MG-63/ADM細(xì)胞組胞核NF-κB P65表達(dá)明顯低于MG-63/ADM細(xì)胞組（不加藥物）（P < 0.05）。 結(jié)論 CMC可部分逆轉(zhuǎn)MG-63/ADM細(xì)胞的耐藥現(xiàn)象的作用，其機(jī)制可能與通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路激活而抑制P-gp表達(dá)相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 羧甲基殼聚糖；骨肉瘤；耐藥；MG-63細(xì)胞株

[中圖分類(lèi)號(hào)] R738 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）09（c）-0004-05

[Abstract] Objective To observe the effect of reversing drug resistance of carboxymethyl chitosan （CMC） on human osteosarcoma resistant cell line MG-63/ADM and preliminary explore its mechanism. Methods Human osteosarcoma drug resistant MG-63/ADM cell line was cultured in vitro. The drug resistance was detected by MTT； after 24， 48 and 72 h of osteosarcoma MG-63 /ADM cells were treated with CMC + adriamycin 2.0 μg/mL， and the inhibition rate of cell proliferation in each group was measured by MTT method. The expression of P-gp in MG-63/ADM cells and the expression of NF-κB P65 protein in nucleus of MG-63/ADM cells after treated with the different concentrations of CMC were detected by Western blot. Results MTT results showed that MG-63/ADM cells were resistant to adriamycin， IC50 was （1.97±0.56） g/mL， the resistance index was 11.35； CMC could significantly inhibit MG-63/ADM cells proliferation， and the inhibitory effect was time and dose dependent （P < 0.01）. Western blot test results showed that the expression of P-gp in MG-63/ADM group was significantly higher than that in MG-63 group （P < 0.05）， and the expression of P-gp in MG-63/ADM treated with different concentrations of CMC was significantly lower than that in MG-63/ADM group （without drugs） （P < 0.05）. The expression level of NF-κB/P65 in MG-63/ADM group was significantly higher than that in MG-63 cell group （P < 0.05）. The expression of NF-κB P65 in the nucleus of CMC + ADM group was significantly lower than that of the control group （MG-63/ADM） （P < 0.05）. Conclusion Carboxymethyl can partly reverse the multidrug resistance in MG-63/ADM cells， and its mechanism may be related to the inhibition of NF-κB signaling pathway and the inhibition of P-gp expression.

[Key words] Carboxymethyl chitosan； Osteosarcoma； Drug resistance； MG-63 cell line

骨肉瘤是發(fā)病率最高的原發(fā)性骨惡性腫瘤，多見(jiàn)于10～20歲青少年，惡性程度高，易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，且預(yù)后差[1]。骨肉瘤好發(fā)于四肢骨，上肢多發(fā)生于肱骨近端，下肢多發(fā)生于脛骨近端以及股骨遠(yuǎn)端。骨肉瘤傳統(tǒng)的治療方法是截肢術(shù)[2]。20世紀(jì)80年代以來(lái)，逐步形成了新輔助化療聯(lián)合保肢手術(shù)及術(shù)后輔助化療的新的骨肉瘤治療策略，使患者5年生存率較之前提高近50%[3]。雖然保肢手術(shù)已經(jīng)很成熟，然而仍有部分患者因腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移使得保肢治療失敗，導(dǎo)致治療效果不佳。其主要原因之一是這部分患者對(duì)骨肉瘤的化療藥物產(chǎn)生了多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）[4]。因此，進(jìn)一步明確骨肉瘤耐藥的機(jī)制并尋找能預(yù)防或逆轉(zhuǎn)耐藥的方法既是目前骨肉瘤治療研究的熱點(diǎn)之一，也是臨床迫切需要解決的問(wèn)題。甲殼素是自然界中存在的唯一帶陽(yáng)離子的天然多糖，廣泛存在于蝦、蟹等甲殼動(dòng)物及各類(lèi)昆蟲(chóng)的表皮；甲殼素脫乙?；漠a(chǎn)物稱(chēng)為殼聚糖[5]（chitosan，CTS）。羧甲基殼聚糖（carboxymethyl chitosan，CMC）為殼聚糖羧甲基基團(tuán)修飾后的衍生物。有研究表明，CTS及CMC具有一定的抗腫瘤、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等活性[6-7]。CMC是否對(duì)耐藥細(xì)胞有逆轉(zhuǎn)耐藥作用，目前臨床鮮有報(bào)道。本研究采用阿霉素（ADM）濃度遞增培養(yǎng)法沖擊誘導(dǎo)建立人骨肉瘤阿霉素耐藥株（MG-63/ADM），觀察CMC對(duì)體外培養(yǎng)的MG-63/ADM細(xì)胞對(duì)ADM的耐藥逆轉(zhuǎn)作用，并初步探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

人骨肉瘤MG-63細(xì)胞株（購(gòu)自武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物保藏中心）；RPMI 1640培養(yǎng)基（美國(guó)，Hyclone）；胎牛血清（FBS）（美國(guó)，Gibco）；MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（碧云天生物科技有限公司）；青霉素、鏈霉素溶液（雙抗）（美國(guó)，HyClone）；Trizol（美國(guó)，Invitrogen）；阿霉素（Doxorubicin，ADM）由Sigma公司提供；MTT試劑盒（武漢科昊佳生物科技有限公司）；羧甲基殼聚糖（武漢大學(xué)資環(huán)學(xué)院惠贈(zèng)）；蛋白抽提-亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)胞漿和胞核蛋白提取試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），Western blot單克隆抗體均購(gòu)自Santa Cruz公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶及96孔培養(yǎng)板由Coring公司生產(chǎn)，細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)，Thermo）；Olympus IX70倒置熒光顯微鏡（日本，Olympus）；自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器（美國(guó)，Thermo）；紫外凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)，Bio-Rad）；DYCz-24D型雙垂直電泳槽（北京六一儀器廠）；JY-ECP3000型高壓多用電泳儀（北京君意儀器有限公司）；UV-1000紫外透射分析儀（上海鄂禾儀器有限公司）；Lambda Bio 20型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)，PerkinElmer）。

1.2 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.2.1 MG-63細(xì)胞ADM耐藥株的建立 按文獻(xiàn)方法[8-9]，先用低濃度的ADM誘導(dǎo)作用MG-63細(xì)胞，然后ADM濃度逐步遞增，通過(guò)間歇作用的方法誘導(dǎo)細(xì)胞耐藥。首先，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MG-63細(xì)胞接種至含ADM的DMEM培養(yǎng)液中，ADM從0.05 mg/L的低濃度開(kāi)始，作用48 h后即棄去含ADM的培養(yǎng)液，重新加入不含ADM的培養(yǎng)液培養(yǎng)，使其恢復(fù)正常生長(zhǎng)，待MG-63細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶底80%～90%時(shí)進(jìn)行胰酶消化傳代，隨后用濃度為0.1 mg/L的ADM處理傳代腫瘤細(xì)胞48 h。按以上方法，重復(fù)ADM處理、換液培養(yǎng)、傳代的培養(yǎng)過(guò)程，在此過(guò)程中按照0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 μg/mL逐步遞增ADM藥物濃度。將MG-63細(xì)胞在2 μg/mL的ADM中可以穩(wěn)定生長(zhǎng)時(shí)所獲得的耐藥細(xì)胞株命名為MG-63/ADM，整個(gè)耐藥誘導(dǎo)歷時(shí)70 d。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中每4周重復(fù)檢測(cè)1次該細(xì)胞的耐藥性。

1.2.2 MG-63/ADM細(xì)胞的耐藥性檢測(cè)（MTT法） 將MG-63、MG-63/ADM用DMEM培養(yǎng)液，于培養(yǎng)箱中37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，待兩種細(xì)胞均生長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶底80%～90%時(shí)行0.25%胰酶消化，然后800 r/min離心10 min，去除上清，分別收集兩種細(xì)胞并接種于96孔板（1×104/孔），繼續(xù)DMEM培養(yǎng)24 h后分組培養(yǎng)。處理組：加入含2 μg/mL濃度ADM的DMEM培養(yǎng)液；陰性對(duì)照組：加不含藥物的培養(yǎng)基；空白調(diào)零組：無(wú)細(xì)胞，只加培養(yǎng)基，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。將各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，各組均取24、48、72 h時(shí)間點(diǎn)去除培養(yǎng)基行MTT檢測(cè)。按MTT試劑盒方法，每孔加入100 μL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h去除上清（不能移走結(jié)晶），每孔加入150 μL的二甲基亞砜，搖床低速震蕩10 min待結(jié)晶溶解，全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定OD值（490 nm吸光度）。細(xì)胞抑制率（inhibition rate，IR）計(jì)算公式：IR（%）=1-[（實(shí)驗(yàn)組OD值-調(diào)零組OD值）/（對(duì)照組OD值-調(diào)零組OD值）]×100%。

根據(jù)文獻(xiàn)方法[10]，采用SPSS 18.0 probit analysis法計(jì)算ADM對(duì)MG-63、MG-63/ADM細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（half effective inhibition concentrations，IC50）；根據(jù)IC50的值計(jì)算耐藥指數(shù)（resistance index，RI），RI=耐藥組IC50/親代細(xì)胞IC50。

1.2.3 MTT檢測(cè)CMC對(duì)人MG-63/ADM細(xì)胞增殖活性的影響 培養(yǎng)MG-63/ADM細(xì)胞至培養(yǎng)瓶底80%～90%時(shí)（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期），行0.25%胰酶消化，然后800 r/min離心10 min，去除上清，收集細(xì)胞并接種于96孔板（1×104/孔），細(xì)胞貼壁培養(yǎng)24 h后分組。ADM組：ADM 2.0 μg/mL；ADM+CMC組：不同濃度（50、100、200 μmol/L）的CMC+ADM 2.0 μg/mL；CMC組：不同濃度（50、100、200 μmol/L）的CMC，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每孔終體積為200 μL。各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，取0、24、48、72 h時(shí)間點(diǎn)去除培養(yǎng)基行MTT檢測(cè)。按MTT試劑盒方法，每孔加入100 μL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h去除上清（不能移走結(jié)晶），每孔加入150 μL的DMSO，搖床低速震蕩10 min溶解結(jié)晶，全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定OD值（490 nm吸光度）。計(jì)算每組生長(zhǎng)抑制率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。生長(zhǎng)抑制率公式：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=[1-（實(shí)驗(yàn)組OD值）/（對(duì)照組OD值）]×100%。

1.2.4 Western blot檢測(cè)細(xì)胞膜P-gp及核轉(zhuǎn)錄因子-κB P65（NF-κB P65）的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)分組：①M(fèi)G-63組；②MG-63/ADM組；③MG-63/ADM+CMC組（CMC 50、100、200 μmol/L，48 h）。蛋白提取步驟：①PBS洗細(xì)胞3次；②加入裂解緩沖液（1.5×106個(gè)細(xì)胞大約加入100 μL裂解液），冰上放置20 min；③收集裂解液；④12 000 r/min離心2～10 min；⑤吸取上清，蛋白定量，分裝，保存在-80℃?zhèn)溆?。蛋白提取裂解液采用胞漿和胞核蛋白提取試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。蛋白濃度檢測(cè)用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒按操作說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定。電泳方法：①配制10%的SDS-PAGE膠；②將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，充分混合沉淀后加Loading buffer后直接上樣，樣品兩側(cè)的泳道用等體積的1×Loading buffer上樣，Marker采用1×Loading buffer調(diào)整至與樣品等體積；③用恒流30 mA電泳至目的蛋白泳動(dòng)至距膠下緣1 cm以上結(jié)束（約1 h）；④轉(zhuǎn)膜：采用濕轉(zhuǎn)法，恒流100 mA過(guò)夜轉(zhuǎn)膜，將P-gp及NF-κB p65蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜。隨后進(jìn)行封閉劑雜交：將膜移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉1 h，而后加入單克隆小鼠抗P-gp抗體（1∶500）、多克隆兔抗NF-κB p65抗體（1∶400）和單克隆小鼠抗β-actin抗體（1∶1000），在37℃孵育1 h后轉(zhuǎn)至4℃孵育過(guò)夜，以TBS-T洗滌3次，每次5 min，加入對(duì)應(yīng)二抗：山羊抗小鼠IgG抗體或山羊抗兔IgG抗體，于室溫輕搖1 h。二抗孵育結(jié)束后，用PBST漂洗膜后再浸洗3次，每次5～10 min。用HRP-ECL發(fā)光法按試劑盒步驟進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，并用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的吸光度，并將膜片進(jìn)行掃描或拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人骨肉瘤MG-63細(xì)胞ADM耐藥株的建立

采用ADM大劑量間隙作用法對(duì)人骨肉瘤MG-63細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)誘導(dǎo)，成功建立了對(duì)ADM耐藥的細(xì)胞株MG-63/ADM（歷時(shí)約70 d，可在2 μg/mL的ADM穩(wěn)定生長(zhǎng)）。

2.2 MTT法檢測(cè)MG-63/ADM細(xì)胞的耐藥性

采用MTT法檢測(cè)MG-6組3及MG-63/ADM細(xì)胞組對(duì)ADM的IC50，發(fā)現(xiàn)MG-63/ADM細(xì)胞組的IC50（1.97±0.56）明顯高于MG-63細(xì)胞組（0.16±0.07），同時(shí)MG-63/ADM組的RI（11.35）顯著高于MG-63細(xì)胞組（1.00），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

2.3 CMC對(duì)MG-63/ADM細(xì)胞增殖的影響

MTT結(jié)果顯示，加入CMC后MG-63/ADM細(xì)胞+ADM組的細(xì)胞增殖明顯被抑制，且在CMC濃度為50、100、200 μmol/L時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增加（F = 3.89、4.99、5.78，均P < 0.05）；在CMC作用24、48、72 h時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率隨CMC濃度的升高而增加（F = 4.69、5.77、7.14，均P < 0.05）；CMC+ADM組與ADM組及CMC組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 5.46、6.37、6.49，均P < 0.05）。見(jiàn)表1。

2.4 CMC對(duì)MG-63/ADM細(xì)胞中P-gp和細(xì)胞核中NF-κB P65表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果表明，MG-63/ADM細(xì)胞組P-gp表達(dá)水平較MG-63細(xì)胞組表達(dá)明顯上調(diào)（P < 0.05），且MG-63/ADM細(xì)胞組細(xì)胞核中NF-κB P65的表達(dá)水平較對(duì)照組MG-63細(xì)胞組明顯上調(diào)（P < 0.05）。MG-63/ADM細(xì)胞+CMC組P-gp的表達(dá)水平較MG-63/ADM細(xì)胞組（不加藥物）明顯下調(diào)（P < 0.05），MG-63/ADM細(xì)胞+CMC組細(xì)胞核NF-κB P65的表達(dá)水平較MG-63/ADM細(xì)胞組明顯下調(diào)（P < 0.05），且呈劑量依賴(lài)性。見(jiàn)表2，圖1。

3 討論

骨肉瘤多藥耐藥是該病復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的主要因素之一。體外研究其耐藥機(jī)制及逆轉(zhuǎn)方法的條件及基礎(chǔ)是建立骨肉瘤的耐藥細(xì)胞株。大量研究表明，通過(guò)持續(xù)誘導(dǎo)或大劑量間歇誘導(dǎo)等方法體外誘導(dǎo)建立骨肉瘤多藥耐藥細(xì)胞株是可行的[8-9]。大劑量間歇誘導(dǎo)法更接近臨床化療實(shí)際。因此，本研究采用了大劑量間歇誘導(dǎo)法。骨肉瘤化療的主要藥物包括鉑類(lèi)、蒽環(huán)類(lèi)、達(dá)卡巴嗪等。其中，ADM是骨肉瘤最主要的化療藥物之一[11]。本研究根據(jù)文獻(xiàn)采取了ADM大劑量間歇干預(yù)人骨肉瘤MG-63細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)約70 d建立了MG-63/ADM，通過(guò)MTT法檢測(cè)該組細(xì)胞耐藥性，發(fā)現(xiàn)MG-63/ADM對(duì)ADM呈中度耐藥，其IC50為（1.97±0.56）μg/mL，RI為11.35。提示該耐藥株具有耐藥性，說(shuō)明成功誘導(dǎo)建立了對(duì)ADM耐藥的人骨肉瘤耐藥細(xì)胞MG-63/ADM。

CTS是自然界中的第二大生物資源，是廣泛存在于甲殼類(lèi)動(dòng)物等生物組織中的一種天然高分子聚合物。其具有較好的生物相容性、生物可降解性、低毒性等特點(diǎn)，在藥物載體、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多方面顯示出了良好的前景[12]。研究表明，CTS可抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖[13]。CMC是殼聚糖最常見(jiàn)的衍生物，經(jīng)CTS醚化改性后的CMC具有更好的水溶性和生物相容性[14]。楊靖亞等[15]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CMC可抑制Hela細(xì)胞和LS174-T細(xì)胞的增殖。張敏等[16]發(fā)現(xiàn)CMC可以抑制口腔癌及癌前病變細(xì)胞黏附和侵襲。CMC對(duì)多藥耐藥細(xì)胞，特別是對(duì)骨肉瘤多藥耐藥細(xì)胞的影響，目前鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究顯示，CMC可部分逆轉(zhuǎn)人骨肉瘤MG-63/ADM耐藥細(xì)胞株對(duì)ADM的耐藥。

目前，已知的骨肉瘤多藥耐藥的產(chǎn)生機(jī)制主要有：化療藥物的排出增多，如P-gp的外排泵藥機(jī)制；細(xì)胞解毒增強(qiáng)，如谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（GST）的細(xì)胞解毒作用；細(xì)胞凋亡抑制；骨肉瘤干細(xì)胞；自噬相關(guān)化療抵抗等機(jī)制相關(guān)[17-19]。其中P-gp介導(dǎo)的藥物外排機(jī)制，是經(jīng)典的多藥耐藥產(chǎn)生機(jī)制之一，但其具體調(diào)節(jié)過(guò)程及調(diào)節(jié)因素仍不完全明確。在多種耐藥的腫瘤細(xì)胞系中存在著異常的NF-κB的表達(dá)[20]。朱文魏等[21]研究認(rèn)為，NF-κB p65蛋白參與皮膚鱗狀細(xì)胞癌的形成和發(fā)展，隨患者病情的進(jìn)展，NF-κB p65蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率越高。隋華等[22]發(fā)現(xiàn)，在人結(jié)腸HCT-116/L-OHP細(xì)胞中，NF-κB與ABCB1基因在啟動(dòng)子區(qū)域相結(jié)合，啟動(dòng)ABCB1基因的轉(zhuǎn)錄，引起P-gp的過(guò)表達(dá)，從而增強(qiáng)耐藥。本研究結(jié)果顯示，MG-63/ADM細(xì)胞組較MG-63細(xì)胞組P-gp表達(dá)明顯上調(diào)，且細(xì)胞核NF-κB P65表達(dá)增加。推測(cè)在人骨肉瘤耐藥細(xì)胞中，P-gp導(dǎo)致的耐藥與NF-κB P65信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，CMC可逆轉(zhuǎn)MG-63/ADM細(xì)胞耐藥，即通過(guò)下調(diào)P-gp及NF-κB P65表達(dá)實(shí)現(xiàn)，推測(cè)CMC逆轉(zhuǎn)骨肉瘤耐藥機(jī)制可能與抑制細(xì)胞核NF-κB信號(hào)通路相關(guān)。

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