毛旭華 欒超 胡煜 董卉妍 蔣明軍 陳敏

214200江蘇，宜興市人民醫(yī)院檢驗科（毛旭華）；中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院皮膚病研究所（欒超、胡煜、蔣明軍、陳敏）；徐州醫(yī)科大學（董卉妍）

近年研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化異常在銀屑病發(fā)病機制中起一定作用。DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMT）是一類在DNA甲基化過程中起重要調(diào)控作用的酶，在真核生物中它分為3個家族，即DNMT1、DNMT2和DNMT3。DNMT1在銀屑病皮損中異常表達［1］，而DNMT2和DNMT3a在胃癌組織中均有異常表達［2］。本研究采用實時定量PCR技術(shù)檢測銀屑病患者表皮中DNMT2和DNMT3a的表達，探討DNMT2和DNMT3a與銀屑病發(fā)病機制的關(guān)系。

一、資料和方法

1.臨床資料：入選標準：尋常性斑塊狀銀屑病患者，年齡18～65歲，4周內(nèi)未系統(tǒng)用藥物，2周內(nèi)未外用藥物，不伴感染、其他自身免疫性疾病及腫瘤。46例銀屑病患者來自2009年3月至2010年12月中國醫(yī)學科學院皮膚病醫(yī)院皮膚科及宜興市人民醫(yī)院皮膚科門診。全部為蘇皖地區(qū)漢族人。男33例，女13例；年齡18～65歲，病程1～30年，銀屑病皮損面積和嚴重程度指數(shù)（PASI）5.1～46.2。25例為進行期，21例為穩(wěn)定期。46例患者同時采集皮損及周圍外觀正常皮膚。28例對照組標本來自中國醫(yī)學科學院皮膚病醫(yī)院皮膚外科美容手術(shù)切除的蘇皖地區(qū)健康漢族人正常皮膚，男21例，女7例。銀屑病組和對照組間年齡和性別分布差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。本研究已獲中國醫(yī)學科學院皮膚病醫(yī)院和宜興市人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

2.主要試劑和儀器：分散酶（美國Roche公司），RNA提取和純化試劑盒（美國Qiagen公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Promega公司），Hot Taq DNA聚合酶（美國Promega公司）。引物由南京金斯瑞生物工程技術(shù)服務有限公司合成，其序列為：DNMT2正向引物 5′?AAGCTGTAAGCCAGCCCATATA?3′，反向5′?TCAGCAGTGAACAGAACCTACATG?3′，片段長度148 bp；DNMT3a正向引物5′?TTCTACCGCCTCCTGCATGAT ?3′，反向5′?GCGAGATGTCCCTCTTGTCACTA ?3′，片段長度113 bp；內(nèi)參照β肌動蛋白正向引物5′?CAGTCGGTTGGAGC GAGCAT ?3′，反向5′?GGACTTCCTGTAACAACGCATCT ?3′，片段長度112 bp。ABI7500實時定量PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品。

3.標本采集和真表皮分離：用6mm環(huán)鉆分別鉆取銀屑病患者皮損和皮損邊緣3 cm外的正常皮膚（非皮損），置-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?.25%分散酶消化患者及對照皮膚標本16～20 h，分離出表皮，置于用焦碳酸二乙酯水處理過的玻璃研磨器中勻漿化。

4.實時定量PCR檢測皮膚組織中DNMT2和DNMT3a mRNA：取勻漿按照Qiagen公司說明書提取總RNA，檢測RNA的含量和純度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作合成cDNA。產(chǎn)物置-20℃保存待PCR擴增。實時定量PCR擴增反應體系包括2倍RTmix 12.5μl，模板（cDNA稀釋10倍）2μl（0.2μmol/L），2μmol/L正向和反向引物各2.5μl，加無核酸酶水至25μl。短暫離心后上樣，每個樣本做3個復孔。反應條件為：95℃預變性2 min，95℃變性5 s，60℃退火30 s，共40個循環(huán)。熔解曲線分析：溫度60℃～95℃，溫度間隔0.3℃，時間為5 s。ΔCt為目的基因與內(nèi)參基因的Ct差值。通過2?ΔΔCt將mRNA表達數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為線性形式進行統(tǒng)計分析。

5.統(tǒng)計學分析：采用SPSS 11.5軟件包進行統(tǒng)計分析，組間比較采用獨立樣本t檢驗，顯著性檢驗水平為0.05。

二、結(jié)果

1.表皮DNMT2mRNA的表達：銀屑病組與對照組表皮均檢測出DNMT2 mRNA表達。皮損、非皮損和對照組DNMT2mRNA表達水平（2?ΔΔCt值）分別是0.62 ± 0.02、0.36 ±0.05和0.15±0.11，皮損組明顯高于非皮損組（t=6.23，P＜0.01），非皮損組明顯高于對照組（t=7.33，P＜0.01）。

2.表皮DNMT3amRNA的表達：銀屑病組與對照組表皮均檢測出DNMT3amRNA表達?；颊咂p、非皮損和對照組表皮中 DNMT3amRNA 表達水平（2?ΔΔCt值）分別是 0.85 ±0.03、0.43±0.04和0.18±0.09，皮損組明顯高于非皮損組（t=5.66，P ＜0.01），非皮損組明顯高于對照組（t=8.62，P ＜0.01）。

三、討論

我們曾在銀屑病皮損中發(fā)現(xiàn)，P16基因啟動子區(qū)域甲基化異常，50%啟動子CPG島發(fā)生甲基化改變［3］。在銀屑病患者皮膚中，甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT1和MeCP2均存在異常表達［1］，HLA I類分子C位點啟動子區(qū)域甲基化異常［4］。

本研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者皮損表皮中DNMT2和DNMT3amRNA表達明顯高于非皮損表皮，且非皮損表皮又高于正常對照組。而之前的研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病皮損中DNMT1mRNA的表達低于正常對照組，而另一種重要的DNA甲基化酶MeCP2mRNA的表達高于正常對照組［1］。有報道銀屑病患者外周血單一核細胞中DNMT1高表達，MeCP2 低表達，未發(fā)現(xiàn)DNMT3a和DNMT3b異常表達［5］。由此推斷，銀屑病患者皮損與外周血中各甲基化相關(guān)基因的表達并不一致。