巴桑玉珍，扎 桑，王玉林，徐齊君，原紅軍，尼瑪扎西

（1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)研究所，西藏拉薩850002；2.省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西藏拉薩850002；3.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院，西藏拉薩850002）

青稞（Hordeum vulgareL.var.nudumHook.f.）屬禾本科大麥屬，是栽培大麥的變種，成熟時(shí)籽粒內(nèi)外稃與穎果分離，籽粒裸露，也稱裸大麥。青稞是高原特色農(nóng)作物之一，有獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)和保健作用，具有顯著的利用價(jià)值，為藏族人民主要糧食作物，其產(chǎn)量高低直接關(guān)系到藏區(qū)人民的經(jīng)濟(jì)和生活[1]。青稞主要生長(zhǎng)在海拔高、溫度低、降水量少、蒸發(fā)量大、日照長(zhǎng)、晝夜溫差大的地區(qū)，對(duì)環(huán)境的抗逆性較強(qiáng)。因此，探究青稞的抗逆機(jī)制和光合機(jī)制對(duì)于選育適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)量高、綜合性狀優(yōu)良的青稞品種具有重要的意義。

長(zhǎng)期以來，人們?cè)噲D通過各種手段來提高作物產(chǎn)量，其中提高作物光合速率是提高產(chǎn)量的重要手段，因此，光合機(jī)理的研究近年來日益受到研究者的重視[2]。在植物光合作用中，卡爾文循環(huán)（Calvin cycle）在CO2的同化過程中發(fā)揮著重要作用，其相關(guān)酶活性的變化直接影響光合產(chǎn)物的積累。核糖-5-磷酸異構(gòu)酶（ribose-5-phosphate isomerase，RPIA）、核酮糖-磷酸3-異構(gòu)酶（ribulose-phosphate 3-epimerase，RPE）、 蘋 果 酸 脫 氫 酶 （malate dehydrogenase，MDH） 和果糖 -1,6-二磷酸激酶（fructose-1,6-bisphosphatase，F(xiàn)BP）等均參與了該過程。RPIA是自然界中廣泛存在的一種高度保守的蛋白酶，參與原核生物和真核生物的糖代謝（如磷酸戊糖途徑），同時(shí)在卡爾文循環(huán)中必不可少，其能夠促使R5P（ribose-5-phosphate）和 Ru5P（ribulose-5-phosphate）進(jìn)行相互轉(zhuǎn)化[3-4]；RPE在卡爾文循環(huán)和磷酸戊糖途徑中均發(fā)揮著重要作用，其與核酮糖-1,5-二磷酸（ribulose 1,5-bisphosphate）的再生相關(guān)[5-6]；MDH 在卡爾文循環(huán)中負(fù)責(zé)將NAD+轉(zhuǎn)化成NADH，提供還原力[7]；FBP在卡爾文循環(huán)中負(fù)責(zé)將果糖-1,6-二磷酸轉(zhuǎn)化成果糖 -6- 磷酸[8]。目前，在水稻[9-10]、玉米[11-13]、油菜[14]、番茄[15-17]、擬南芥[18-20]等植物中大量的光合相關(guān)基因已經(jīng)得到了克隆，而在青稞中還未見報(bào)道。因此，我們以青稞品種甘農(nóng)大7號(hào)為材料，進(jìn)行4個(gè)光合作用相關(guān)酶編碼基因的克隆并做了生物信息學(xué)分析，旨在為進(jìn)一步研究青稞的光合作用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

青稞品種甘農(nóng)大7號(hào)由西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)研究所和青海省農(nóng)林科學(xué)院提供，該品種通過嚴(yán)格的育種選擇程序而得到，籽粒飽滿，抗白粉病，不耐貧瘠。

1.2 方法

1.2.1 青稞種苗總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄。取適量的青稞種子播種于富含有機(jī)質(zhì)的盆栽土壤中，正常澆水管理，待植株生長(zhǎng)至2～3片葉時(shí)，采用Analytikiena公司的Jena InnuPREP RNA Mini Kit提取新鮮葉片RNA，采用Qiagen公司的TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，cDNA樣本于-20℃保存。

1.2.2 4個(gè)光合作用相關(guān)基因的克隆。以前期不同時(shí)期干旱復(fù)水誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析結(jié)果為基礎(chǔ)，利用Primer Premier 5.0軟件分別設(shè)計(jì)02833、03360、45441和45453這4個(gè)光合作用相關(guān)基因的特異引物（表1）。

表1 引物列表

RT-PCR反應(yīng)在S-1000 Thermal Cycler進(jìn)行，反應(yīng)體系采用20 μL PCR擴(kuò)增體積：TaqDNA聚合酶 (TaKaRa，5 U/μL)0.2 μL，10×PCR 反應(yīng)緩沖液(Takara)2 μL，dNTP(10 mmol/L)1.6 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各 0.8 μL，cDNA 2 μL，滅菌水 12.6 μL。反應(yīng)條件：94℃變性5 min；94℃變性1 min，58℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，30循環(huán)；72℃延伸10 min。分別回收目標(biāo)片段，克隆于pMD18-T載體上，挑陽性菌測(cè)序。

1.2.3 4個(gè)基因的生物信息學(xué)分析。根據(jù)測(cè)序得到的02833、03360、45441和 45453基因序列，推測(cè)其編碼序列（coding sequences,CDS）和氨基酸序列，利用NCBI（http://ncbi.nlm.nih.gov/）、ORFfinder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）、ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）、Conserved domains（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）、TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）、Signal IP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）、PredictProtein（https://ppopen.rostlab.org/）和 SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）等網(wǎng)絡(luò)資源對(duì)02833、03360、45441和45453基因進(jìn)行序列分析。

圖1 02833、03360、45441和45453基因擴(kuò)增結(jié)果

2 結(jié)果與分析

2.1 02833、03360、45441和45453基因的克隆

以電子克隆延伸得到的序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)特異引物，擴(kuò)增甘農(nóng)大7號(hào)青稞苗期葉片的cDNA，分別特異性獲得513、822、1 023和579 bp的4條cDNA序列（圖1），測(cè)序分析顯示這4條片段序列如圖2所示，與預(yù)期的基因序列基本一致，表明02833、03360、45441和45453基因擴(kuò)增成功。

2.2 02833、03360、45441和45453基因的生物信息學(xué)分析

根據(jù)獲得的 02833、03360、45441 和 45453 基因序列信息，在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Blastn比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)02833可能編碼一個(gè)核糖-5-磷酸異構(gòu)酶3，其與山羊草、小麥、二穗短柄草、水稻等核酸序列的相似性分別為92%、88%、86%和85%，NCBI上登陸的02833基因CDS全長(zhǎng)為831 bp，編碼270個(gè)氨基酸，本研究中所得為02833基因的CDS部分片段。

03360可能編碼一個(gè)核酮糖-磷酸3-異構(gòu)酶，其與山羊草、小麥、二穗短柄草、水稻等相應(yīng)核酸序列的相似性分別為96%、96%、93%和88%，根據(jù)NCBI在線軟件ORFfinder，推測(cè)青稞03360的CDS全長(zhǎng)為822 bp，進(jìn)一步以得到的CDS推測(cè)氨基酸序列，預(yù)測(cè)03360基因編碼一個(gè)273個(gè)氨基酸的多肽，分子量為 29.6 kDa，等電點(diǎn)（pI）為 8.61（圖 3）；將該氨基酸序列進(jìn)行Blastp比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，該氨基酸序列屬于ICL_KPHMT superfamily家族之一，含有典型的ICL_KPHMT superfamily結(jié)構(gòu)域（圖4）；通過TargetP對(duì)03360蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)肽進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其不存在轉(zhuǎn)運(yùn)肽，為胞漿蛋白，利用TMHMM Server V2.0在線軟件對(duì)03360蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其不存在跨膜區(qū)（圖5）。

圖 2 02833(a)、03360(b)、45441(c)和 45453(d)基因片段測(cè)序結(jié)果

圖3 03360基因CDS及其編碼氨基酸的全長(zhǎng)序列

圖4 03360基因Blastp對(duì)比圖

圖5 03360跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析

圖6 45441基因CDS及其編碼氨基酸的全長(zhǎng)序列

45441基因編碼一個(gè)340個(gè)氨基酸的多肽，預(yù)測(cè)分子量為36 kDa，等電點(diǎn)（pI）為 8.24，這個(gè)多肽可能是一個(gè)蘋果酸脫氫酶，其與山羊草、二穗短柄草、水稻和玉米等核酸序列的相似性分別為96%、92%、88%和87%，根據(jù)NCBI在線軟件ORF finder，推測(cè)青稞45441的CDS全長(zhǎng)為1 023 bp，進(jìn)一步以得到的CDS推測(cè)氨基酸序列（圖6），將該氨基酸序列進(jìn)行Blastp比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，該氨基酸序列屬于Ldh_1_C superfamily家族之一，含有典型的Ldh_1_C superfamily結(jié)構(gòu)域（圖 7）；通過 TargetP對(duì)45441蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)肽進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其不存在轉(zhuǎn)運(yùn)肽，為胞漿蛋白。利用TMHMM Server V2.0在線軟件對(duì)45441蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其不存在跨膜區(qū)(圖8)。

45453基因可能編碼一個(gè)果糖-1,6-二磷酸激酶，其與山羊草序列的相似性為95%。

圖7 45441基因Blastp對(duì)比圖

圖8 45441跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析

3 結(jié)論與討論

中國(guó)具極端條件的耕地面積遼闊，地形復(fù)雜，培育適于各種極端環(huán)境條件且高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的農(nóng)作物是研究者持之以恒的目標(biāo)。青稞可以在青藏高原高海拔、高寒的極端條件下生長(zhǎng)，對(duì)環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)性；同時(shí)青稞自身具有一定的保健功能。因此，青稞這一特殊種質(zhì)資源具有很大的利用價(jià)值，研究其光合機(jī)制對(duì)于選育適應(yīng)極端環(huán)境條件的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的農(nóng)作物具有重要意義。RPIA、RPE、MDH和FBP是光合作用過程中參與卡爾文循環(huán)的4個(gè)重要的酶，其活性的變化直接影響卡爾文循環(huán)的進(jìn)行，最終對(duì)光合產(chǎn)物的合成產(chǎn)生影響。Mantin等從菠菜葉綠體中克隆得到了一個(gè)RPIA基因，該基因與卡爾文循環(huán)及氧化戊糖磷酸途徑相關(guān)，推測(cè)其編碼239個(gè)氨基酸[3]；Paul等發(fā)現(xiàn)擬南芥RPIA基因RSW10與纖維素合成相關(guān)，其突變體中纖維素合成受阻[21]；此外，Schreier等研究發(fā)現(xiàn)RPIA還與植物防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)[22]。這說明，RPIA的功能存在多樣性，不僅僅局限于光合作用中。針對(duì)RPE的研究發(fā)現(xiàn)，RPE在卡爾文循環(huán)和磷酸戊糖途徑中均發(fā)揮著重要作用，其與核酮糖-1,5-二磷酸（ribulose 1,5-bisphosphate）的再生相關(guān)[5-6]。Tesfaye等研究發(fā)現(xiàn)，在苜蓿中過表達(dá)MDH能夠提高轉(zhuǎn)基因植株中有機(jī)酸的合成，增強(qiáng)植株對(duì)鋁離子和酸性土壤的適應(yīng)性[23]，而Nunes-nesi等發(fā)現(xiàn)在番茄中反義表達(dá)線粒體MDH基因能夠增強(qiáng)植株的光合性能[24]。此外，研究表明，MDH在卡爾文循環(huán)中負(fù)責(zé)將NAD+轉(zhuǎn)化成NADH，提供還原力[7]，這說明MDH的功能同樣存在多樣性，可能與植物光合作用和抵抗逆境密切相關(guān)。對(duì)FBP的研究發(fā)現(xiàn)，其在卡爾文循環(huán)中負(fù)責(zé)將果糖-1,6-二磷酸轉(zhuǎn)化成果糖-6-磷酸[8]。綜上，RPIA、RPE、MDH和FBP等除了與光合作用相關(guān)外，還可能與植物抵抗逆境相關(guān)，進(jìn)一步研究青稞中這些基因的功能，不僅能夠揭示青稞的光合機(jī)制，也有可能提供青稞適應(yīng)極端條件的分子依據(jù)。本研究中克隆得到的 02833、03360、45441和 45453基因分別對(duì)應(yīng)于這4個(gè)酶的編碼序列，這些基因的分離和鑒定為下一步的研究奠定了基礎(chǔ)。

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